عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للفأر عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا في النماذج الحيوانية لإزالة الميالين
أبريل 5, 2022
هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في النماذج الحيوانية لأمراض إزالة الميالين ، باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا العمودي.
يساعد هذا البروتوكول على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن آفات إزالة الميالين المجهرية في دماغ الفأر البالغ لدراسة الخصائص الدبقية الدقيقة في الجسم الحي. توفر هذه التقنية الوقت ولها متطلبات أقل لكل من المجربين والمعدات. تساعد هذه الطريقة على عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن دماغ الحيوان ، وخاصة تلك الأنسجة المجهرية في حالات مرضية مختلفة.
ابدأ بالتشريح المجهري للآفات الموسومة بصبغة محايدة حول الجسم الثفني تحت المجهر المجسم. الطرد المركزي للأنسجة المشرطة في 300 مرة غرام لمدة 30 ثانية لجمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب. مزيج إنزيم التسخين المسبق واحد ومزيج الإنزيم من اثنين إلى 37 درجة مئوية في حاضنة.
ثم ، أضف 1،950 ميكرولتر من الإنزيم المسخن مسبقا ، وامزج عينة واحدة إلى عينة واحدة ، وهضمها في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أضف 30 ميكرولتر من الإنزيم المسخن مسبقا ، واخلطه بلطف. بعد الهضم ، أضف أربعة ملليلترات من PBS البارد إلى الأنبوب ، ورجه بلطف.
الطرد المركزي لعينات الأنسجة في 300 مرة غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وشفط supernatant ببطء وبشكل كامل. أعد تعليق حبيبات الخلية بلطف باستخدام 1،550 ميكرولتر من PBS الباردة. أضف 450 ميكرولتر من المحلول البارد لإزالة الحطام ، واخلطها جيدا.
استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتراكب الخليط ببطء شديد ، وبلطف مع ملليلتر من PBS الباردة. الطرد المركزي للخليط ، ثم ابحث عن الطبقات الثلاث. استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لشفط الطبقتين العلويتين بالكامل ، واملأ الأنبوب حتى خمسة ملليلترات بمخزن مؤقت للتحميل البارد.
قلب الأنبوب بلطف ثلاث مرات. بعد ذلك ، بعد الطرد المركزي وشفط supernatant ، أعد تعليق بيليه الخلية مع 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل ، وأضف 10 ميكرولترات من حبات CD11b. تخلط جيدا ، وتحضن لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة ، أضف ملليلتر واحد من مخزن التحميل المؤقت ، واغسل الخلايا عن طريق سحب السائل بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. الطرد المركزي للخلايا في 300 مرة غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وشفط supernatant تماما لإزالة الخرز غير المقيد. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت ، وضع عمود MS مع الفاصل الخاص به للاختيار الإيجابي في المجال المغناطيسي.
شطف العمود مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل لحماية الخلايا وضمان كفاءة الفرز المغناطيسي على أساس بروتوكول الشركة المصنعة. قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود MS ، وتخلص من التدفق الذي يحتوي على الخلايا غير المسماة. أضف 500 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت لغسل العمود وإزالته من الفاصل.
ضع العمود على أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر، وأضف ملليلتر واحد من مخزن التحميل المؤقت إلى العمود. أخيرا ، ادفع المكبس إلى أسفل العمود لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا. يظهر هنا تمثيل تخطيطي لاستراتيجية البوابة المستخدمة في تحليل التدفق الخلوي للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من آفات إزالة الميالين للفئران البالغة قبل وبعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا.
تمثل الصور الرسومية ارتفاع التشتت الأمامي وارتفاع التشتت الجانبي لاختيار الخلايا ومنطقة التشتت الأمامي وارتفاع التشتت الأمامي لاختيار الخلايا المفردة وCD11b-FITC وCD45-APC لاختيار الخلايا النخاعية والخلايا الدبقية الصغيرة. زادت نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل كبير بعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا. تمثل الصورة الرسومية استراتيجية البوابة المستخدمة في تحليل التدفق الخلوي للخلايا المفردة الحية والميتة بعد فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا.
هنا ، تم استخدام 7-aminoactinomycin D وارتفاع التشتت الجانبي لاختيار الخلايا الحية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر تشريح الآفات المزيلة للميالين بدقة تحت المجهر المجسم بناء على العلامات الحمراء المحايدة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لعزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من آفات إزالة الميالين في أدمغة الفئران البالغة. وباستخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسياً عبر الأعمدة، تسهل هذه الطريقة دراسة خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي مع تحسين متطلبات الوقت والموارد.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الأمراض العصبية
خلفية علمية
- تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة أدوارًا حاسمة في الالتهاب العصبي وأمراض الجهاز العصبي المركزي.
- يعد فهم وظيفتها في حالات زوال الميالين أمرًا ضروريًا لفهم آليات المرض.
- هناك حاجة إلى تقنيات عزل فعالة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة التي تتميز بحالات مرضية محددة.
- تركز الطريقة المقدمة على تعزيز الكفاءة في عزل هذه الخلايا.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول موثوق لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من مناطق محددة في الدماغ.
- تسهيل دراسة سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة وأدوارها في سياق أمراض إزالة الميالين.
- تحسين استخدام الموارد أثناء عملية العزل.
الطرق المستخدمة
- التشريح المجهري للأنسجة من آفات إزالة الميالين باستخدام المجهر المجسم.
- استخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسياً بالأعمدة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة.
- تتضمن الخطوات هضم الأنسجة، والطرد المركزي، وإعادة التعليق برفق لضمان عزل الخلايا بكفاءة.
- تشمل الخطوات الرئيسية تحضير الإنزيم، وتسلسلات متعددة من الطرد المركزي، والتعامل الدقيق مع عينات الخلايا الدبقية الصغيرة.
النتائج الرئيسية
- يعمل هذا البروتوكول على تحسين نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل ملحوظ.
- أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي نجاح فرز الخلايا النخاعية والتحديد الدقيق للخلايا الدبقية الصغيرة.
- تم إجراء صبغ الخلايا الحية والميتة لتقييم حيوية الخلايا والتأكد من نجاح عملية الفرز.
- تتيح هذه الطريقة فهماً أكثر شمولاً لاستجابات الخلايا الدبقية الصغيرة في حالات زوال الميالين.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة طريقة فعالة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، مما يسهل الأبحاث المستقبلية حول دورها في الأمراض العصبية.
- تساهم تقنية العزل هذه في تطوير المعرفة بسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي، مما يجعلها قابلة للتطبيق في نماذج مرضية متنوعة.
- يمكن لهذا البروتوكول أن يعزز الدراسات التي تهدف إلى التدخلات العلاجية التي تستهدف وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض التنكسية العصبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يسمح العزل الفعال للخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من أنسجة دماغ الفأر منزوعة الميالين بإجراء استقصاء دقيق للاستجابات المناعية الفطرية في نماذج الجهاز العصبي المركزي ذات الصلة بالمرض. وتدعم هذه القدرة تقليل المخاطر الميكانيكية والتحقق من الأهداف لمسارات علاج الأمراض الالتهابية العصبية وأمراض إزالة الميالين. كما تسهل تحضيرات الخلايا الدبقية الصغيرة عالية النقاوة الاستمرارية الترجمية بدءاً من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى الأبحاث قبل السريرية في محافظ المناعة العصبية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استجواب حالات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والتباين المظهري في أنسجة الجهاز العصبي المركزي ذات الصلة بالمرض.
- يدعم التحقق من صحة الأهداف الوظيفية من خلال الحفاظ على الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة المستخلصة من الآفات المرضية.
- يسهل تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف المرتبطة بالالتهاب العصبي عن طريق عزل الخلايا الأولية من النماذج الحية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر خلايا ميكروغليا أولية تم التحقق من صحتها لإجراء المقاييس الوظيفية اللاحقة وفحص المركبات.
- يعزز من إمكانية تكرار المقاييس وتوحيد معاييرها من خلال توفير مجموعات خلوية حية وعالية النقاء.
- يتيح قراءات كمية باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد هوية الخلايا وحيويتها، مما يدعم تطوير مقاييس تحليلية قوية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يتوافق مع النماذج ذات الصلة بالمرض لاكتشاف المؤشرات الحيوية الانتقالية في الحالات المزيلة للميالين.
- يحافظ على الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف في الجسم الحي إلى التحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على الملفات الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة.
- يدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال تمكين الدراسة المباشرة لاستجابات الخلايا الدبقية الصغيرة في بيئات الجهاز العصبي المركزي المرضية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يتكامل هذا البروتوكول ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية لأبحاث الأمراض الالتهابية العصبية والمزيلة للنخاعين.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وعدم تجانسها في آفات الجهاز العصبي المركزي.
- الفحص: يوفر خلايا دبقية صغيرة عالية النقاء وقابلة للتكرار للاختبارات الوظيفية والمظهرية.
- التحليلات: يتيح تحليل قياس التدفق الخلوي الكمي لهوية الخلايا، وحيويتها، والتحولات في تعدادها.
- الأبحاث الانتقالية: يحافظ على السمات الجزيئية ذات الصلة بالمرض لدراسات المؤشرات الحيوية والآليات المسببة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لسير عمل موحد لعزل الخلايا المناعية الأولية للجهاز العصبي المركزي عبر مختلف النماذج.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف المناعية العصبية والدراسات الميكانيكية.
- القيمة التشغيلية: تبسط عملية عزل الخلايا مع تقليل المتطلبات من المعدات والخبرات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن جودة اتخاذ قرارات المتابعة أو التوقف (go/no-go) من خلال تمكين الدراسة المباشرة للخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من نماذج الأمراض.
- التأثير على مجموعة المشاريع: تقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة وتدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر في مسارات أبحاث الالتهاب العصبي.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب إتقان التشريح الدقيق والتعامل مع أنسجة الجهاز العصبي المركزي تحت المجهر المجسم.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة فرز الخلايا المفعلة مغناطيسياً وقياس التدفق الخلوي لأغراض التحقق.
- يستلزم توحيد معايير معالجة الأنسجة واستراتيجيات تحديد البوابات (gating strategies) بين الفرق لضمان إمكانية تكرار النتائج.
- قد يلزم إجراء تعديلات لمناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي أو لنماذج مرضية مختلفة للحفاظ على نقاء الخلايا وحيويتها.
- يعد التحديد الدقيق للآفات والتعامل الحذر مع العينات أمراً بالغ الأهمية للحفاظ على الخصائص الجزيئية.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
