الكشف في الوقت الحقيقي والتقاط المجموعات الفرعية للخلايا الغازية من الثقافات المشتركة

تمكن هذه التقنية من تحديد الخلايا ذات القدرات الغازية المختلفة تحت تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية المستزرعة. تقوم هذه التقنية بتقييم تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية أو المناعية المستزرعة على غزو الخلايا. كما يسمح باستعادة وتحليل المجموعات الفرعية للخلايا الغازية الموجودة في خلطات الخلايا غير المتجانسة.

يمكن لهذه التقنية تحديد الأورام التي تؤوي مجموعات فرعية من الخلايا الغازية التي تؤدي إلى ورم خبيث. قد يؤدي التقاط الخلايا السرطانية الغازية وتحليلها إلى اتخاذ قرارات العلاج. لبدء زراعة الخلايا ، اغسل مزارع الخلايا الالتصاق التي تحتوي على ما يقرب من 70٪ من الالتقاء مع 1X محلول ملحي مخزن بفوسفات.

ثم أضف 0.05٪ من التربسين ومحلول EDTA لرفع الخلايا. تحييد محلول التربسين باستخدام وسائط زراعة الخلايا التي تحتوي على مصل وحساب الخلايا باستخدام أليكوت من تعليق الخلية. ضع جميع الغرف المعقمة الثلاث في غطاء محرك السيارة لزراعة الأنسجة.

حدد موقع المقبض على الجانب القصير من الغرفة السفلية وقم بتوجيه الغرفة السفلية بحيث يواجه المقبض المجرب. أضف 30،000 إلى 50،000 خلية في 90 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر من الغرفة السفلية دون تشكيل أي فقاعات. استخدم 5٪ من الوسائط المكملة لمصل البقر الجنيني في غرفتين سفليتين كعنصر تحكم إيجابي في حركة الخلايا ، واستخدم 0٪ وسائط مكملة للمصل كعنصر تحكم سلبي.

قم بتدوير الغرفة السفلية عند 90 درجة بعد تركها تستقر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في غطاء المحرك. ثم ضع الغرفة الوسطى في الأعلى بحيث ينزلق المقبض الموجود في الغرفة السفلية إلى الشق الموجود في الغرفة الوسطى. ادفع الغرفة عموديا لأسفل حتى تسمع نقرة من كل جانب من الجوانب الطويلة للتجميع.

أضف 160 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى جميع آبار الغرفة الوسطى. تأكد من رؤية الغضروف المفصلي على شكل قبة بعد ملء الآبار ووضع الغرفة العلوية مع أقطاب كهربائية متجهة لأسفل إلى الغرفة الوسطى لمحاذاة النقاط الزرقاء على الحجرتين الوسطى والعليا. ادفع الغرفة عموديا لأسفل حتى يتم سماع صوت نقرة من كل جانب من الجوانب الطويلة للتجميع.

أضف 20 إلى 50 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى الغرفة العلوية. قم بتركيب التجميع على محلل الخلايا ثنائي الغرض في حاضنة زراعة الأنسجة وانتظر 30 دقيقة قبل قياس الخلفية. افتح برنامج محلل الخلايا ، ثم حدد المهد المراد استخدامه ، متبوعا بنقرة واحدة على علامة تبويب الرسالة ، وتأكد من أنه يقول اتصالات بخير "لضمان وضع الصفيف بشكل جيد في المهد وأن الأقطاب الكهربائية محاذاة بشكل جيد مع أجهزة الاستشعار.

انقر على علامة التبويب ملاحظات التجربة واملأ جميع المعلومات الممكنة حول التجربة. ثم انقر فوق علامة التبويب تخطيط واملأ وصف تخطيط الصفيف. ثم انقر فوق علامة التبويب الجدول الزمني وأضف خطوتين من قائمة الخطوات ، وخطوة خلفية مع مسح واحد ، وخطوة اختبار مع 100 عملية مسح.

بمجرد أن تكون المصفوفة في حاضنة تحليل الخلايا ثنائية الغرض لمدة 30 دقيقة ، انقر فوق زر التشغيل لبدء قياس الخلفية. بعد الانتهاء من قياس الخلفية ، قم بإزالة الصفيف من المهد وضعه مرة أخرى في غطاء مزرعة الخلية. ثم أضف 30،000 إلى 50،000 خلية في 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى كل بئر من الغرفة العلوية.

هذه هي الخلايا التي سيكتشفها القطب الكهربائي بمجرد أن تهاجر بنجاح عبر الغشاء. دع التجميع يقف في غطاء المحرك لمدة 30 دقيقة قبل تركيبه على محلل الخلايا ثنائي الغرض لقياس المعاوقة. ضع الصفيف مرة أخرى في محلل الخلايا ثنائي الغرض وتحقق من علامة تبويب الرسالة الخاصة برسالة "اتصالات موافق".

انقر فوق زر التشغيل لبدء قياس المعاوقة ثم انقر فوق علامة التبويب المؤامرة لمراقبة تقدم الإشارة. إذا تم الوصول إلى نقطة النهاية قبل 25 ساعة ، فانقر فوق خطوة الإجهاض من القائمة المنسدلة تنفيذ. لتصدير البيانات، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني، واختر نسخ بتنسيق القائمة، ثم الصق البيانات في جدول بيانات.

راقب معدل الترحيل في الوقت الفعلي على محلل الخلايا ثنائي الغرض لتحديد نقطة التوقف المثيرة للاهتمام. بمجرد تحقيقه ، قم بفك التجميع من محلل الخلايا ثنائي الغرض وضعه في غطاء محرك الأنسجة. إعداد عدد مناسب من 1.5 ملليلتر من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لجمع الخلايا من الآبار ذات الاهتمام.

ضع التجميع في طبق طوله 10 سنتيمترات لاحتواء السوائل عند انفصال الغرف. ادفع أطراف الانجذاب المرنة على الجانب الطويل من الغرفة الوسطى إلى الداخل حتى يتم سماع صوت نقرة ، يليه تفكيك الغرفة العلوية وقلبها إلى طبق جديد بطول 10 سم. استخدم رافع خلايا بشفرة 13 ملم لجمع الخلايا من جميع الآبار التي تؤوي نفس الحالة التجريبية.

شطف أو غمس الشفرة في 1X الفوسفات المخزنة المالحة لجمع الخلايا في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر. ثم قم بتدوير الخلايا بسرعة 500 مرة G لمدة خمس دقائق ونشر هذه الخلايا التي تم جمعها أو إجراء تحليل نقطة النهاية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. أظهر تقييم غزو الخلايا في وجود أو عدم وجود خلايا لحمية أن غزو خلايا MDA-MB-231 قد تعزز عندما كانت سلالة الخلايا الليفية السويسرية 3T3 J2 المشععة جالسة في الغرفة السفلية لتبادل العوامل بين خطي الخلية.

ومن المثير للاهتمام ، زاد غزو MDA-MB-231 عندما تضاعف عدد خلايا 3T3 J2. من ناحية أخرى ، يبدو أن معدل غزو استنساخ غازي لخلايا MCFDCIS ، DCIS-Delta Four ، قد تم تثبيطه بواسطة التداخل مع خلايا 3T3 J2 ، مما يشير إلى التطبيق القيم لمصفوفة الغرف الثلاث لقياس التأثيرات المختلفة للسدى. في هذه الحالة ، الخلايا الليفية على غزو الخلايا.

كانت الخلايا البطانية للوريد السري البشري أكثر توغلا استجابة للعوامل التي تفرزها خلايا MDA-MB-231 ، على عكس تلك التي تفرزها خلايا DCIS ، والتي تتوافق مع قدرة الأورام الغازية على تجنيد الخلايا البطانية لتشكيل الأوعية الدموية ونشرها لاحقا في الدورة الدموية. زاد غزو خلايا xenograft المشتقة من المريض من الغرفة العلوية استجابة للخلايا المناعية لنخاع العظم البشري المستزرع. ومن المثير للاهتمام ، أن وجود مصل 2٪ في الغرفة السفلية مع الخلايا المناعية لنخاع العظم البشري كان ضروريا لغزو xenografts المشتق من المريض.

يمكن طلاء الآبار بمصفوفة خارج الخلية لتقليد حاجز الغشاء السفلي. يمكن إضافة عوامل علاجية إلى وسائل الإعلام في الآبار لمراقبة تأثيرها على الغزو.