الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت
مارس 16, 2022
يمكن أيضا تحقيق خرائط cryo-EM عالية الدقة للجزيئات الكبيرة باستخدام مجاهر TEM 200 kV. يعرض هذا البروتوكول أفضل الممارسات لوضع محاذاة بصريات دقيقة ، ومخططات الحصول على البيانات ، واختيار مناطق التصوير التي تعد جميعها ضرورية للجمع الناجح لمجموعات البيانات عالية الدقة باستخدام TEM 200 كيلو فولت.
أصبح Cryo-EM تقنية قياسية لتحديد بنية البروتينات ومجمعاتها. يصف هذا البروتوكول أفضل الممارسات المتعلقة بكيفية الحصول على مجموعات بيانات Cryo-EM عالية الدقة من مجاهر TEM متوسطة المدى 200 كيلو فولت. يمكن ل Cryo-EM تحديد بنية البروتين في ظروف قريبة من الأصل في محلول لحالات توافقية متعددة وحالات وظيفية في وقت واحد ، وهو أمر بعيد المنال بالنسبة للتقنيات الهيكلية الأخرى.
يمكن استخدام المعلومات الهيكلية التي تم الحصول عليها لتوضيح الآليات الجزيئية لوظيفة البروتين ، وكذلك لتصميم الأدوية القائمة على الهيكل. على سبيل المثال ، كشف منشور حديث في بنية ألياف الأميلويد عن مواقع ربط متعددة للرباط الحيوي. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، نستخدم العينات القياسية من الأبوفيريتين والبروتيازوم لإظهار الخطوات الحاسمة في الحصول على بيانات Cryo-EM عالية الدقة.
أصبح تشغيل Cryo-TEM أكثر سهولة على مدار السنوات الماضية ، خاصة بسبب إدخال ميزات الأتمتة المتقدمة. ومع ذلك ، بالنسبة للجلسة الأولى ، ننصحك بالحصول على تدريب مع مستخدمين أكثر خبرة. من هناك ، فإن التقدم في هذه التقنية سريع نسبيا.
سيوضح الإجراء أدريان كوه ، وهو عالم تطبيقات كبير في Thermo Fisher Scientific. أدخل شبكات تلقائية في علبة اللودر التلقائي تحت ظروف النيتروجين السائل. أدخل الكاسيت مع شبكات السيارات في كبسولة نقل مبردة بالنيتروجين السائل.
أدخل الكبسولة في المجهر وانقر على زر Dock في واجهة مستخدم المجهر لتحميل الكاسيت من الكبسولة إلى اللودر التلقائي للمجهر. انقر فوق الزر "المخزون" للتحقق من وجود شبكات تلقائية في الكاسيت المحمل. ثم انقر فوق أزرار التحميل وإلغاء التحميل لإدراج الشبكات التلقائية في العمود لتصوير TEM.
حدد علامة التبويب أطلس وانقر على زر جلسة جديدة لفتح جلسة جديدة. املأ التفاصيل مثل اسم الجلسة وموقع تخزين البيانات وانقر فوق الزر تطبيق. حدد الشبكات ذات الأهمية عن طريق تحديد خانة اختيار بجوار رقم الشبكة المقابل.
انقر فوق الزر ابدأ لبدء مجموعة مؤتمتة بالكامل من أطالس جميع الشبكات المحددة. عند اكتمال المجموعة ، انقر فوق ملصقات الشبكة لمراجعة الأطالس المكتسبة. حدد علامة التبويب EPU وانتقل إلى جلسة جديدة لإنشاء جلسة جديدة في اللوحة اليمنى.
حدد خيار جلسة عمل جديدة لاستخدام الإعدادات البصرية المسبقة الحالية المحددة. املأ اسم الجلسة. حدد النوع اليدوي للجلسة للتحكم في تحديد الثقوب الفردية ومربعات الشبكة المحددة لجمع البيانات لاحقا في البروتوكول.
حدد وضع الاكتساب الأسرع لاستخدام تحويل الصور الخالي من الانحراف لجمع البيانات. ثم أدخل الموقع لحفظ البيانات الوصفية. انقر فوق الزر "تطبيق" لإنشاء جلسة جديدة.
حدد مهمة تحديد المربع في اللوحة اليمنى لإظهار الأطلس الذي تم جمعه للشبكة. حدد مربعات الشبكة باستخدام رقائق دعم سليمة دون تلف ، وثقوب رقيقة من الجليد الزجاجي والرقائق ، وتلوث الجليد البلوري الضئيل في مربع الشبكة والحد الأدنى من تدرج السطوع عبر مربع الشبكة وداخل ثقوب الرقائق الفردية. حدد مربعات الشبكة لجمع البيانات، إما في الأطلس الكامل أو صور التجانب عالية الجودة.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق مربع شبكة ذي أهمية واختر مهمة التحديد بأكملها. انقر فوق الزر Auto Eucentric للانتقال تلقائيا إلى مربع الشبكة المحدد الأول. اضبط الارتفاع المتمركز والحصول على صورة مربعة للشبكة للعثور على ثقوب الرقائق.
انقر فوق الزر "البحث عن ثقوب" للعثور على ثقوب الرقائق في الصورة. انقر فوق الزر إزالة الثقوب لإغلاق زر شريط الشبكة لإلغاء تحديد الثقوب بالقرب من أشرطة الشبكة. اضبط الحدود في الرسم البياني للسطوع لمرشح الجليد لإزالة جميع الثقوب ذات الجليد السميك جدا وجميع الثقوب الفارغة.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق ثقب في صورة مربع الشبكة وحدد مرحلة نقل إلى مرحلة نقل الموقع هنا. حدد مهمة تعريف القالب في اللوحة اليمنى. انقر فوق الزر "اكتساب" للحصول على صورة كاملة.
اضبط قيم التأخير بعد إزاحة الصورة على 0.5 ثانية والتأخير بعد إزاحة المرحلة على خمس ثوان. انقر فوق الزر "البحث عن ثقب وتوسيطه" لتوسيط ثقب في الصورة. حدد الزر "إضافة منطقة استحواذ" وانقر على الصورة لتحديد الموقع في الحفرة المركزية حيث سيتم التقاط صورة عالية التكبير.
حدد الزر إضافة منطقة تركيز تلقائي وانقر على الصورة لتحديد الموقع على رقاقة الدعم بجوار الفتحة المركزية حيث سيتم تنفيذ التركيز التلقائي للصورة. انقر فوق منطقة الاستحواذ الخضراء لتعيين سلسلة من قيم إلغاء التركيز البؤري في قائمة إلغاء التركيز البؤري في القسم العلوي من نافذة البرنامج. بعد تعيين الإعدادات الخاصة بالتركيز البؤري التلقائي، حدد الخيار بعد التوسيط للتركيز البؤري التلقائي في بداية كل مجموعة AFIS.
اختر الخيار Objective Lens للحصول على تركيز بؤري تلقائي أسرع وتقليل انحراف المرحلة. انقر فوق الزر إعداد جميع المربعات في مهمة تحديد الثقب لتعيين جمع البيانات وجميع مربعات الشبكة المحددة الأخرى تلقائيا وفقا للإعدادات المستخدمة في مربع الشبكة الأول هذا. حدد مهمة تعريف القالب ، واحصل على صورة جديدة ، وانقل المرحلة إلى منطقة نظيفة على رقائق الكربون بالنقر بزر الماوس الأيمن وحدد خيار القائمة نقل المرحلة هنا.
حدد علامة التبويب الوظائف التلقائية. بعد تعيين إلغاء التركيز البؤري والتكرار المطلوبين ، قم بالتبديل إلى الإعداد المسبق للتركيز البؤري التلقائي وانقر فوق زر البدء لتشغيل وظيفة التركيز البؤري التلقائي. حدد مهمة Autostigmate ، وقم بالتبديل إلى الإعداد المسبق ل Thon Ring واضغط على زر البدء .
حدد مهمة Autocoma واضغط على زر البدء ( Start) . نقل المرحلة إلى منطقة بها مربع شبكة مكسور. تأكد من شفافية المساحة من خلال التقاط صورة تركيز بؤري تلقائي واحدة.
افتح واجهة مستخدم Sherpa وحدد تطبيق فلتر الطاقة. انقر فوق الزر "مركز" وخيار "صفر فقدان" لتوسيط شق مرشح الطاقة صفر الخسارة. انقر فوق الزر Tune في خيار isoochmaticity.
انقر على خيار تكبير اللحن وتشوهات اللحن في التشوهات الهندسية واللونية. انتقل إلى علامة التبويب EPU ، وحدد مهمة الاستحواذ التلقائي وانقر فوق الزر "بدء التشغيل" لبدء جمع البيانات المؤتمتة بالكامل. يوضح الشكل شبكات Cryo-EM التي تعرض تدرجا من سمك الجليد على سطح الشبكة.
الشبكات المستبعدة من التحقيق الإضافي هي شبكة سيئة ذات جليد سميك وشبكة منحنية ذات جليد سيئ وتلوث ، في حين أن الشبكات المقبولة هي تلك ذات التدرج الجليدي الجيد والشبكة النموذجية ذات الجليد الرقيق الجيد والتدرج الجليدي الصغير. يوضح الشكل العرض النهائي 3D لخريطة apoferritin Cryo-EM المعاد بناؤها. إن الثبات والتماثل العاليين يجعلانها عينة معيارية مثالية لتصوير Cryo-EM عالي الدقة ومعالجة الصور.
أدى تلميع بايزي ، وتحسين CTF ، وتصحيح كرة Ewald إلى خريطة دقة 1.63 angstrom. يوضح الشكل عرضا مفصلا لخريطة apoferritin Cryo-EM المعاد بناؤها على مستوى السلسلة الجانبية الفردية للأحماض الأمينية. يتم حل كثافة سلاسل جانب الأحماض الأمينية بشكل جيد ويمكن بناء النموذج الذري بشكل لا لبس فيه داخل الخريطة.
تظهر الصورة هنا مجموعتين مختلفتين من البيانات بقيم مختلفة لإلغاء التركيز البؤري تم جمعها من نفس شبكة Cryo-EM مع مربعات شبكة مماثلة مع شق مفتوح بالكامل وشق 10 إلكترون فولت مما يشير إلى أن شق 10 إلكترون فولت يحسن بشكل كبير من تباين الصورة. يوضح الشكل الوارد هنا نظرة عامة على خريطة Cryo-EM البروتيازوم 20S مع وحدات فرعية مجزأة تستخدم كعينة Cryo-EM قياسية. وتمثل طريقة العرض المكبرة مع نموذج ذري مجهز النواة الحفازة المستقرة لمجمع البروتيازوم مع تناظر D7.
يحتوي البروتوكول على خطوتين حاسمتين. الأول ، البحث عن مناطق ذات جليد زجاجي رقيق يحتوي على جزيئات متجانسة. وثانيا، إعداد إضاءة متوازية للحصول على البيانات.
مع إعادة بناء البروتينات عالية الدقة التي تحقق اثنين إلى ثلاثة أنغستروم في الدقة ، فأنت أكثر قدرة على فهم الآليات الجزيئية للمرض وتحسين خيوط الدواء. في السابق ، كان التبلور ضروريا إذا كنت ترغب في دراسة الأساس الهيكلي للظواهر البيولوجية. اليوم مع Cryo-EM ، لم يعد ذلك ضروريا.
وهكذا مع Cryo-EM ، نمكن العلماء من دراسة مجموعة واسعة من الظواهر البيولوجية على المستوى الهيكلي.
النظرة العامة
يحدد هذا البروتوكول أفضل الممارسات للحصول على مجموعات بيانات cryo-EM عالية الدقة باستخدام المجاهر TEM بجهد 200 كيلو فولت. يركز على محاذاة البصريات الدقيقة، ومخططات الحصول على البيانات، واختيار منطقة التصوير.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- مجهر cryo-Electron
- علم الأحياء البنيوي
الخلفية
- cryo-EM هي تقنية قياسية لتحديد بنية البروتين.
- تتيح دراسة البروتينات في ظروف قريبة من الظروف الطبيعية.
- يمكن لهذه الطريقة التقاط حالات تشكلية ووظيفية متعددة في وقت واحد.
- التطورات الحديثة جعلت تشغيل المجهر cryo-TEM أسهل.
غرض الدراسة
- لإظهار الخطوات الحاسمة في الحصول على بيانات cryo-EM عالية الدقة.
- لتوفير بروتوكول لاستخدام عينات قياسية مثل apoferritin والبروتيازوم.
- لتسهيل تصميم الأدوية المستند إلى البنية من خلال معلومات هيكلية مفصلة.
الطرق المستخدمة
- استخدام الشبكات الآلية وظروف النيتروجين السائل لتحضير العينات.
- التجميع الآلي للأطلس من الشبكات المختارة.
- الاختيار اليدوي لمربعات الشبكة لجمع البيانات.
- استخدام ميزات الأتمتة المتقدمة للحصول على البيانات بكفاءة.
النتائج الرئيسية
- الحصول الناجح على مجموعات بيانات عالية الدقة من المجاهر TEM بجهد 200 كيلو فولت.
- تحديد مربعات الشبكة المثلى للتصوير.
- إظهار تقنيات جمع البيانات الآلية واليدوية.
- وضع بروتوكول موثوق به للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول دليلًا شاملاً للحصول على بيانات cryo-EM عالية الدقة.
- يوصى بالتدريب مع مستخدمين ذوي خبرة للمبتدئين.
- تعزز التطورات في الأتمتة كفاءة عمليات cryo-EM.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution cryo-EM using 200 kV TEM systems enables routine atomic-level protein structure determination, expanding access beyond specialized 300 kV platforms. Automation and real-time quality assessment streamline data acquisition, supporting rapid, reproducible generation of structural insights for early-stage drug discovery. This capability strengthens predictive confidence at the target validation and lead identification inflection points across biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables elucidation of molecular mechanisms underlying protein function and disease relevance.
- Supports structure-based drug design by providing atomic-resolution maps for target interrogation.
- Facilitates functional target validation through direct visualization of conformational and binding states.
- Reduces reliance on crystallization, broadening the range of tractable targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated structural templates for downstream screening and assay development workflows.
- Standardizes imaging parameters and data quality, ensuring reproducibility across experiments.
- Enables quantitative assessment of ligand binding and conformational changes.
- Supports scalable, automated data collection for high-throughput structural screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural outputs with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by clarifying structure-function relationships.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions 200 kV cryo-EM as a core capability from early discovery through preclinical research, bridging target validation, lead identification, and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein structures in near-native states.
- Screening: Provides reproducible, quantitative structural data for compound evaluation and assay readiness.
- Analytics: Enables high-resolution measurements and statistical comparison of structural conditions and ligand interactions.
- Translational Research: Connects atomic-level insights to disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, automated workflow adaptable across diverse protein targets and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation and real-time quality control.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM operation and data interpretation, with initial training recommended.
- Needs access to 200 kV TEM systems equipped with energy filters and direct electron detectors.
- Demands robust data management and quality assessment infrastructure for high-throughput workflows.
- Standardization of imaging parameters and automation protocols is critical for cross-team reproducibility.
- Adaptation to specific protein targets may require optimization of sample preparation and imaging conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Grid Loading, Mapping, and Selection of Best Cryo-EM Grids for Data Collection
2:36
Setting up a Data Collection Session in the Single Particle Analysis Software
5:44
Final Microscope Alignments Before Starting Data Collection
7:15
Results: Gallery of Grids, Cryo-EM Reconstruction of Apo-Ferritin, and Effect of Energy Filtering on Cryo-EM Images
8:56
Conclusion
