تضخيم الإشريكية القولونية في رقاقة الموائع الدقيقة PCR ذات التدفق المستمر واكتشافها باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الشعري

يصف هذا البروتوكول كيفية بناء نظام سلسلة بوليميراز التدفق المستمر على أساس رقاقة الموائع الدقيقة ، وكيفية بناء نظام الرحلان الكهربائي الشعري في المختبر. يقدم طريقة بسيطة لتحليل الأحماض النووية في المختبر. تفاعل البلمرة المتسلسل هو طريقة تقليدية تستخدم لتضخيم الجين المستهدف.

ومع ذلك ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي يستغرق وقتا طويلا للغاية بسبب كفاءة تباين درجات الحرارة المنخفضة. يقترح هذا العمل نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل المستمر التدفق القائم على رقاقة الموائع الدقيقة. يمكن تقليل وقت التضخيم بشكل كبير عن طريق تشغيل محلول PCR في قناة صغيرة موضوعة على سخانات مضبوطة في درجات حرارة مختلفة.

نظرا لأن CE لها العديد من المزايا ، مثل الدقة العالية والسرعة العالية والتكاثر الممتاز ، فقد أصبحت أداة شائعة في المختبر لتحليل الأحماض النووية والبروتينات. ومع ذلك ، فإن معظم المختبرات ، وخاصة المختبرات في العالم النامي ، لا تستطيع تحمل تكلفة هذه التكنولوجيا بسبب ارتفاع سعر أداة CE. هنا ، حددنا بروتوكولات لكيفية تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة CF-PCR وكيفية بناء نظام CE متعدد الاستخدامات في المختبر.

نوضح أيضا عملية تضخيم الإشريكية القولونية بواسطة نظام CF-PCR ، والكشف عن منتجات PCR بواسطة نظام CE. باتباع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول ، يجب أن يكون المستخدمون قادرين على تصنيع رقائق الموائع الدقيقة ، وإعداد محلول تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وبناء نظام CF-PCR لتضخيم الحمض النووي ، وإعداد نظام CE بسيط ، حتى مع الموارد المحدودة ، لفصل شظايا الحمض النووي. سخني رقاقة السيليكون على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة لإزالة الرطوبة.

استغني عن ملليلتر واحد من SU-8 2075 مقاوم للضوء لكل بوصة من الرقاقة. قم بتدويرها على رقاقة السيليكون باستخدام طبقة دوران عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 إلى 10 ثوان مع تسارع 100 دورة في الدقيقة في الثانية ، ثم عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية بتسارع 500 دورة في الدقيقة في الثانية. اخبزيها على حرارة 65 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، و 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

اضبط 150 إلى 215 مللي جول لكل سنتيمتر مربع كطاقة تعرض لآلة الطباعة الحجرية الضوئية ، وقم بنقش النمط المصمم على مقاومة الضوء باستخدام قناع الطباعة الحجرية الضوئية. ضع رقاقة السيليكون والقناع جاهزين للتعرض. بعد التعرض ، اخبز الرقاقة على حرارة 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 95 درجة مئوية لمدة سبع دقائق.

اغمر رقاقة السيليكون في محلول المطور لإزالة المقاومة الزائدة للضوء ، وأخرجها عندما يمكن رؤية القنوات الدقيقة. ثم استخدم الأيزوبروبانول لشطف محلول المطور المتبقي. امزج بوليبوليمر بوليديميثيل سيلوكسان وعامل المعالجة بنسبة 10 إلى 1.

صب محلول PDMS المختلط في قالب النسخة المتماثلة وقم بتثبيته عند 80 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. قم بربط شريحة الموائع الدقيقة PDMS على شريحة بعد التنشيط باستخدام منظف البلازما ، وقم بتثبيتها عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في أسرع وقت ممكن. استخدم خلاط دوامة وأجهزة طرد مركزي لضمان خلط الكواشف جيدا.

إعداد أنبوب الطرد المركزي. أضف الماء أولا إلى أنبوب الطرد المركزي. ثم أضف قالب الحمض النووي ، التمهيدي ، المخزن المؤقت ، خليط dNTP ، Tween 20 ، PVP ، وأخيرا أضف بوليميراز الحمض النووي.

أخيرا ، امزج المحلول بواسطة دوامة. قم بإعداد سخانين من السيراميك PTC ، ومرحلتين للحالة الصلبة ، وجهازي تحكم في درجة الحرارة ، ومستشعرين لدرجة الحرارة ، وسلك طاقة. قم بتوصيل السخان بمرحل الحالة الصلبة.

قم بتوصيل مرحل الحالة الصلبة بجهاز التحكم في درجة الحرارة PID. ثم قم بتوصيل مسبار مستشعر درجة الحرارة بأسفل السخانين ، وقم بتوصيل الطرف بجهاز التحكم في درجة الحرارة PID. أخيرا ، قم بتوصيل مرحلين من الحالة الصلبة في سلسلة ، وقم بتوصيل سلك الطاقة.

3D طباعة فتحة للسخانات اثنين والحفاظ على سخانات على نفس المستوى. ضع شريحة الموائع الدقيقة على السخانين. قم بإعداد مضخة حقنة ومحقنة ، ثم ثبت المحقنة على مضخة المحقنة.

قم بتوصيل أنبوب سيليكون بحقنة ، وقم بتوصيل إبرة فولاذية بأعلى أنبوب السيليكون. أدخل الإبرة الفولاذية في مدخل رقاقة الموائع الدقيقة. ضع طرف ماصة عند مخرج الشريحة لجمع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

استخدم مصدر طاقة عالي الجهد لتوليد مجال كهربائي نابض. انظر ، هذا مصدر طاقة عالي الجهد. هذه أقطاب موجبة وسالبة.

استخدم مصباح الزئبق كمصدر للضوء وقم بتصفية الطول الموجي للإثارة من مصباح الزئبق من خلال مرشح. ضع الشعيرات الدموية على مرحلة المجهر. اجمع انبعاث التألق مع الهدف ، ثم اكتشفه بواسطة أنبوب مضاعف ضوئي.

هذا هو المجهر وهذا هو الشعيرات الدموية. الآن نقوم بتشغيل الضوء في ظل ظروف الغرفة المظلمة. يتم جمع ضوء الإثارة حسب الهدف.

استخدم برنامج LABVIEW المطور ذاتيا للتحكم في مصدر الطاقة وإكمال الحصول على البيانات. اضبط درجة حرارة سخانات نظام CF-PCR مسبقا على 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية. ضع رقاقة الموائع الدقيقة على كتلتي التسخين.

أدخل طرف أنبوب السيليكون في أنبوب طرد مركزي يحتوي على 50 ميكرولتر من محلول PCR. اسحب مكبس المحقنة لسحب المحلول ببطء. ثبت المحقنة على مضخة حقنة.

أدخل الإبرة الفولاذية في مدخل رقاقة الموائع الدقيقة. اضبط معدل تدفق المضخة على 10 ميكرولتر في الدقيقة واضغط على زر البدء لدفع المحلول في القناة الدقيقة عند مدخل الرقاقة. جمع منتجات PCR عند مخرج رقاقة الموائع الدقيقة.

تحضير الشعيرات الدموية مع طول إجمالي 8 سم وطول فعال 6 سم. قم بإعداد مخزن الفصل عن طريق خلط 100 ميكرولتر من 1٪ HEC ، واثنين ميكرولتر من 100x SYBR Green ، و 98 ميكرولتر من الماء عالي النقاء للحصول على 0.5٪ HEC يحتوي على 1x SYBR Green. املأ الشعيرات الدموية بمخزن الفصل المحضر باستخدام مضخة تفريغ.

أدخل جهد الحقن ووقت الحقن على واجهة البرنامج ، وانقر فوق زر البدء ، وانتظر حتى يتم إدخال منتجات PCR كهروديناميكيا في الشعيرات الدموية. أدخل جهد التيار المستمر على واجهة البرنامج ، وانقر فوق زر البدء ، وقم بتشغيل الكهربائي عند 100 فولت لكل سنتيمتر من شدة المجال الكهربائي. انقر فوق زر التوقف بعد فصل جميع أجزاء الحمض النووي (DNA) في الشعيرات الدموية.

اغسل الشعيرات الدموية بالماء المعقم لمدة دقيقة واحدة بعد كل جري. تمثل هذه الصورة مخطط كهربية لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وعلامات الحمض النووي. قمنا أولا بتضخيم الجين المستهدف للإشريكية القولونية في نظام CF-PCR ، واستغرق حل تفاعل البوليميراز المتسلسل حوالي 10 دقائق و 30 ثانية من المدخل إلى مخرج الشريحة.

كان حجم الأمبليكون المستهدف للإشريكية القولونية 544 نقطة أساس. بعد ذلك ، قمنا بتحليل منتجات PCR المضخمة في نظام الرحلان الكهربائي الشعري. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا أيضا الرحلان الكهربائي الشعري لسلم الحمض النووي 100 bp في نفس الظروف التجريبية.

يمكن تقييم حجم منتج PCR وفقا لمخطط كهربية سلم الحمض النووي. تم إجراء كل تجربة ثلاث مرات للتكاثر. تظهر البيانات في هذه الصورة أن الذروة المقابلة لمنتجات PCR من الإشريكية القولونية لوحظت بعد الانفصال ، وكان وقت ترحيل منتجات PCR في رقاقة الموائع الدقيقة متسقا مع تلك الموجودة في دورة حرارية.

كل من PCR و CE هما تقنيتان حيويتان شائعتان في تحليل الأحماض النووية. تصف هذه الورقة تضخيم الإشريكية القولونية والكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أنظمة CF-PCR و CE ، وكلاهما مدمج داخليا. تم تضخيم الجين المستهدف للإشريكية القولونية بنجاح في غضون 10 دقائق ، وتم فصل شظايا الحمض النووي الأصغر من 1،500 نقطة أساس في غضون ثماني دقائق.

أيضا ، من السهل تصنيع نظام CF-PCR القائم على رقاقة الموائع الدقيقة ونظام CE الذي تم تقديمه في هذا العمل ، وقد يوفر طريقة بسيطة لتحليل الأحماض النووية في المختبر. يمكنه تضخيم واكتشاف عينة واحدة فقط في كل مرة ، مما يحد من تطبيقه على نطاق واسع. لذلك ، لا يزال تطوير مجموعة رقائق الموائع الدقيقة CF-PCR و CE المتكاملة للكشف عالي الإنتاجية عن مسببات الأمراض في الطريق.