مجهر القوة الذرية لدراسة الخواص الفيزيائية لخلايا البشرة لجذور الأرابيدوبسيس الحية
March 31st, 2022
يوفر بروتوكول المسافة البادئة المجهرية للقوة الذرية إمكانية تشريح دور الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية لخلية معينة من نسيج أو عضو أثناء النمو الطبيعي أو المقيد (أي تحت عجز الماء).
تسمح هذه الطريقة بتحديد التغيرات في الخواص الفيزيائية لجدار الخلية النباتية أثناء التطور وربط هذه التغييرات المجهرية بنمو عضو بأكمله. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ليست غازية ولا تتطلب أي علاج يسمح بالقياس الكمي في الجسم الحي للخصائص الفيزيائية لجدار الخلية إضافة دقة تحت خلوية سريعة نسبيا. للبدء ، انشر طبقة رقيقة من غراء السيليكون في طبق بتري مع زلة غطاء واتركه في الهواء لمدة 45 ثانية.
باستخدام الملقط ، ضع الشتلات على الغراء ووجه اتجاهها لتجنب التلامس بين الأجزاء البارزة للشتلات والكابولي. ثم اضغط على الجذر برفق على طبقة غراء السيليكون لربطها بإحكام. اتركه لمدة 45 ثانية ، وأضف حل 1X PBS.
قم بتركيب ناتئ نيتريد السيليكون القياسي بطرف هرمي في حامل مسبار AFM للسائل ، وقم بمحاذاة الليزر على الكابولي بالقرب من موضع الطرف. ثم حرك الصمام الثنائي للصور لوضع بقعة الليزر في وسط الكاشف. قم بمعايرة حساسية الانحراف عن طريق إجراء مسافة بادئة بحجم منحدر يبلغ 3 ميكرومتر ، ومعدل مسافة بادئة وتراجع يبلغ 0.6 ميكرومتر في الثانية وعتبة زناد تبلغ 0.5 فولت.
تأكد من أن المسبار لا يتفاعل مع العينة وقم بمعايرة ثابت زنبرك الكابولي. باستخدام الأداة المساعدة للضبط الحراري ، انقر فوق معايرة متبوعة باللحن الحراري أو على أيقونة الضبط الحراري في شريط أدوات نطاق النانو وأدخل درجة حرارة الكابولي. بعد تحديد نطاق التردد ، انقر فوق زر سائل المذبذب التوافقي للعينة.
بعد ذلك ، انقر فوق البيانات المكتسبة في لوحة الضبط الحراري. الآن ، اضبط متوسط عرض المرشح على ثلاثة. اضبط عرض حاوية PSD لتقليل الضوضاء في البيانات المكتسبة عن طريق حساب المتوسط وتعيين حدود الملاءمة حول ذروة الرنين الأولى.
انقر فوق حساب ثابت الربيع K ، ثم انقر فوق نعم في النافذة المنبثقة ، واسأل عما إذا كان المستخدم يريد استخدام هذه القيمة. باستخدام المجهر الضوئي المقلوب عند تكبير قطعة العين 10 و 20 و 40 مرة ، ضع مسبار AFM على سطح خلية البشرة الرابعة الممدودة من الجذر الأساسي لضمان وضعها في وسط الخلية. مع قيمة ثابتة الربيع المحسوبة مسبقا ، تم الحصول على منحنيات قوة بحجم منحدر يبلغ 3 ميكرومتر ، وعتبة الزناد 11 نانونيوتن ، ومعدل المسافة البادئة والتراجع 0.6 ميكرومتر في الثانية في نقاط محددة.
احصل على منحنيات قوة من ثلاث خلايا لكل جذر لكل علاج والتقط ما لا يقل عن 150 منحنى قوة لكل جذر. يوضح هذا المخطط نتيجة متوقعة عند إجراء تجربة المسافة البادئة للقوة على عينات حية موضوعة في مركز خلية منطقة استطالة الجذر. عندما يبدأ طرف AFM في المسافة البادئة ، سطح جدار الخلية ، تبدأ القوة في الزيادة بسبب معارضة جدار الخلية للتشهير.
تستمر زيادة القوة حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى لقيمة القوة. بعد هذه النقطة ، يبدأ جزء التفريغ من المسافة البادئة. تنمو القوة بعد القطع المكافئ في جزء المسافة البادئة ، وهو أمر مهم لتناسب كل منحنى مع نموذج التنبؤ للمسافة البادئة الهرمية المستخدمة في العمليات الحسابية.
كمعلمة مناسبة ، يجب أن يتوافق موضع نقطة الاتصال مع سطح جدار الخلية قبل المسافة البادئة ويعتبر أصل إزاحة طرف AFM. منحنيات القوة التي يستحيل فيها اكتشاف نقطة الاتصال قبل التخلص من المسافة البادئة. علاوة على ذلك ، يجب أن يكون منحنى التحميل والتفريغ لتجربة المسافة البادئة للقوة خاليا من الضوضاء.
بعد تركيب كل منحنى قوة مع النموذج ، تم الحصول على الرسوم البيانية التي أظهرت توزيع تردد القيم التي تم الحصول عليها لمعامل يونغ الظاهر. يوضح هذا الرسم البياني التردد الذي تم الحصول عليه من خلال مجموعة من 201 مسافة بادئة ناجحة على تسع خلايا مختلفة لثلاث نباتات مختلفة من كولومبيا زيرو نمت في ظروف التحكم. قد تكون المسافة البادئة صعبة بالنسبة لبعض الأنماط الجينية بسبب مورفولوجيا الجذر.
على سبيل المثال ، نمت متحولة مزدوجة TTL 1 PRC 1-1 في إجهاد تناضحي شديد. توضح هذه الرسوم البيانية التوزيع الاحتمالي للقيم التي تم الحصول عليها لمعامل يونغ الظاهر من تسع خلايا مختلفة. فقط الرسم البياني H الذي يتوافق مع خلية واحدة يمكن تركيبه على توزيع Gaussian.
يمكن دمج المعدن المعروض هنا مع تقنيات أخرى مثل دراسات معدل النمو أو تحليل التركيب الكيميائي لجدار الخلية. ستكمل هذه التقنيات الأخرى المعلومات لفهم كيفية تأثير التركيب الكيميائي على الخواص الفيزيائية للجدار الخلوي على نمو العضو.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يُمكِّن بروتوكول تصوير الضغط الذري من تحليل الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية النباتية أثناء النمو. تعتبر هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة التغيرات في ظل ظروف مثل نقص الماء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا النبات
- تقنيات التصوير المجهري
الخلفية
- فهم خصائص جدار الخلية أمر بالغ الأهمية لتطور النبات.
- تؤثر الخصائص الفيزيائية على أنماط النمو والاستجابات للتوتر البيئي.
- يوفر تصوير الضغط الذري رؤى عالية الدقة.
- هذه التقنية غير جراحية، مما يسمح بإجراء دراسات داخل الجسم الحي.
غرض الدراسة
- لقياس التغيرات في خصائص جدار الخلية أثناء تطور النبات.
- لربط التغيرات المجهرية بنمو الأعضاء بأكملها.
- للتحقيق في تأثيرات ظروف النمو المقيدة.
الطرق المستخدمة
- تطبيق مادة لاصقة سيليكون لتثبيت الشتلات لإجراء القياسات.
- استخدام محلول PBS للحفاظ على الظروف الخلوية.
- بروتوكول الانطباع لتقييم الخصائص الفيزيائية لجدار الخلية.
- التصوير غير الجراحي لمراقبة ديناميكيات النمو.
النتائج الرئيسية
- أظهرت القدرة على قياس خصائص جدار الخلية داخل الجسم الحي.
- حددت تغيرات كبيرة في الخصائص الفيزيائية تحت ظروف نقص الماء.
- أقامت ارتباطًا بين التغيرات المجهرية ونمو الأعضاء.
- أثبتت فعالية تصوير الضغط الذري لدراسات النبات.
الاستنتاجات
- يعتبر بروتوكول تصوير الضغط الذري أداة قيّمة لأبحاث بيولوجيا النبات.
- يسمح بتحليل مفصل لخصائص جدار الخلية دون علاجات تدخلية.
- تساهم النتائج في فهم نمو النبات في ظل ظروف التوتر.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Quantitative nanoindentation using atomic force microscopy (AFM) enables precise measurement of cell wall mechanics in live Arabidopsis root epidermal cells, supporting hypothesis-driven discovery in plant biology. This capability provides predictive confidence for linking subcellular mechanical changes to organ-level growth, informing early-stage target validation and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's non-invasive, high-resolution outputs facilitate robust portfolio decisions in translational plant research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of cell wall mechanical properties at subcellular resolution.
- Supports mechanistic de-risking by correlating physical changes with developmental processes.
- Facilitates functional validation of genetic or chemical perturbations affecting cell wall integrity.
- Provides high-confidence data for triaging targets in plant growth and stress response pathways.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, quantitative readouts for cell wall stiffness using apparent Young's modulus.
- Standardizes force curve acquisition and analysis for cross-condition comparisons.
- Enables rapid, non-destructive screening of phenotypic effects in live tissues.
- Supports assay scalability for evaluating multiple genotypes or treatments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microscopic mechanical changes with macroscopic organ growth for translational continuity.
- Facilitates integration with growth rate studies and chemical composition analyses.
- Supports risk-adjusted advancement of plant traits relevant to agricultural biotechnology.
- Provides predictive data for preclinical model selection in plant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This AFM-based method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative screening, and translational linkage between cell wall mechanics and organ growth.
- Discovery Biology: Quantifies mechanical properties to clarify pathway function and biological de-risking.
- Screening: Delivers standardized, reproducible force curve data for comparative analysis.
- Analytics: Provides histograms and statistical distributions of Young's modulus for robust condition assessment.
- Translational Research: Connects subcellular mechanical changes to whole-organ growth outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse plant genotypes and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in plant cell wall research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible mechanical measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation in plant trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions in plant pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and force curve analysis.
- Needs access to calibrated AFM instrumentation and optical microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and data interpretation.
- May require adaptation for different plant genotypes or tissue morphologies.
- Limited to external tissues and may be challenging for roots with complex morphology.
