هندسة العوامل المضادة للفيروسات عبر رنين البلازمون السطحي

تم إنشاء التحليل الطيفي بالرنين البلازموني السطحي لتحديد ليجند البروتين بطريقة إنتاجية متوسطة. يتم تقديم صلات مختلفة لمتغيرات موقع الربط لنفس الجزيء ، وهي لقليل السكاريد عالي الجودة المرتبط بالحديد على الفيروسات. SPR هي تقنية خالية من الملصقات لدراسة الارتباط الجزيئي في الوقت الفعلي للمستقبلات الثابتة السطحية.

يتم التعرف على التفاعلات متعددة المواقع في التحليل الحركي عن طريق الربط التنافسي بشكل مستقل عن حجم المجالات المحددة في الأبحاث التي تستخدم SPR هي تطوير الأدوية للبحث عن مثبطات أو توصيف الأجسام المضادة. يتم حساب الثوابت والصلات الحركية مباشرة من استجابة المستشعر. للبدء ، انقل 100 ميكرولتر من المحلول على ألواح LB-agar وانشرها برفق باستخدام موزع خلية معقمة.

ابدأ سلسلة من تفاعلات العينات باستخدام تركيزات متعددة من قالب الحمض النووي المزدوج الشريط تتراوح من خمسة إلى 50 نانوجرام مع الحفاظ على تركيز التمهيدي ثابتا. ثم أضف إنزيم تقييد DpnI أسفل تراكب الزيت المعدني واحتضانه على الفور عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لهضم الحمض النووي الأبوي المزدوج الذي تقطعت به السبل. لإذابة الخلايا فائقة الكفاءة XL1-Blue ، قم بتقسيم الخلايا إلى أنبوب سفلي صغير مستدير مبرد مسبقا.

بعد ذلك ، انقل ميكرولترا واحدا من الحمض النووي أحادي الشريط المعالج من كل عنصر تحكم وتفاعل عينة إلى حصص منفصلة من الخلايا فائقة الكفاءة التي توليف الشريط التكميلي. بعد تحريك تفاعلات التحول بعناية للخلط ، احتضان التفاعلات على الجليد لمدة 30 دقيقة. ضع نبضة حرارية على تفاعلات التحول عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ثم ضع التفاعلات على الجليد لمدة دقيقتين.

ثم أضف 0.5 ملليلتر من NZY + Broth واحتضان تفاعلات التحول عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225 إلى 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بلوحة الحجم الصحيح لكل تفاعل تحويل على ألواح LB Ampicillin Agar كما هو موضح سابقا. بالنسبة لثقافة البذور ، قم بتلقيح كمية صغيرة من الأمبيسلين المحتوي على وسائط LB مع مستعمرة واحدة من اللوحة المحولة.

باستخدام الثقافة الليلية ، قم بتلقيح ثقافة التعبير بإضافات بما في ذلك 10 ملليمولار من كلوريد المغنيسيوم ، و 10 ملليمولار من كبريتات المغنيسيوم ، و 20 ملليمولار من الجلوكوز ، مما يخفف من زراعة البذور إلى واحد في 100. بعد ذلك ، تنمو الخلايا ذات الاهتزاز القوي عند 37 درجة مئوية إلى 600 نانومتر ماص بين 0.4 إلى 0.6 قبل تبريد الخلايا إلى 20 درجة مئوية والحث باستخدام ملليمولار واحد IPTG وتنمو بين عشية وضحاها. ثم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية وتجاهل الطاف .

بعد إعادة تعليق بيليه الخلية في الفوسفات العازلة المالحة المخزنة ، الملجأ الأخير في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم تجاهل الطاف مع ماصة. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 10 ملليلتر من محلول التحلل واحتضان التعليق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

ثم فصل الكسور القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 4،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم HIS-Select Ni2 + Affinity Gel في أنابيب سعة 14 ملليلتر لربط وإعادة تعليق السيانوفيرين-N الموسوم به بشكل مؤتلف في المحاليل العازلة مع 20 ملليمولار إيميدازول و 250 مليمولار إيميدازول ، على التوالي. احتضان دفعة واحدة لمدة 30 دقيقة على الأقل بين هذه الخطوات.

إضافة محلول الشطف الذي يحتوي على 250 مليمولار إيميدازول لتخفيف البروتين. انقل محاليل البروتين إلى أنابيب الطرد المركزي باستخدام مرشح قطع دالتون 10 كيلو وركزها بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 4،500 جم وأربع درجات مئوية. أضف المخزن المؤقت لتشغيل SPR إلى عامل تخفيف من واحد إلى 10 وأجهزة الطرد المركزي أربع مرات إلى الحجم الأولي لمدة 10 دقائق عند 4،500 جم وأربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، حدد تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية NanoDrop بناء على معامل الانقراض المحسوب للبروتين الرئيسي CVN2L0 الذي يظهر حجما 23،474 دالتون. بالنسبة لنظام SPR ثنائي القناة ، استخدم HBSCP plus كمخزن مؤقت قيد التشغيل ، وحمض هيدروكلوريك جليكاين 10 مللي مولار من الأس الهيدروجيني 1.5 إلى 1.6 كمخزن مؤقت للتجديد وقم بتشغيل جهاز إزالة الغازات وأخذ العينات التلقائي والمضخة. ثم اغسل النظام بأكمله بالماء المقطر المزدوج لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، قم بإسقاط زيت الغمر على الكاشف وقم بتركيب شريحة مستشعر زجاجية مطلية بغشاء ذهبي رقيق. وعلى الجانب العلوي ، تعمل مع هيدروجيل كربوكسي ميثيل ديكستران مباشرة على الكاشف أسفل خلية التدفق ثلاثية المنافذ. ثم قم بإصلاح الإعداد عن طريق سحب المناولة لأسفل.

لشل حركة الروابط البروتينية إلى رقائق المستشعر ، افتح جدول تشغيل بالنقر فوق نموذج في شريط القائمة وقم بتشغيل محرر الجدول في برنامج الارتباط التلقائي SPP المدمج. ثم اختر وانقر فوق التثبيت الأساسي من قائمة جداول التشغيل المتاحة واتبع خطوات الإجراء التجريبي على شاشة الكمبيوتر. بعد ذلك ، انقر فوق محرر مجموعة العينات في قسم النموذج لملء قائمة الكواشف لرفين موضوعين في أخذ العينات التلقائي لمزيد من التحليل.

انقر فوق التحكم المباشر في أخذ العينات التلقائي كأداة في شريط القائمة لإعادة الرفوف إلى الأمام أو إلى المنزل واختيار أربع درجات مئوية كدرجة حرارة التشغيل. ابدأ تشغيل المضخة لضخ الماء المقطر المزدوج عن طريق النقر على الأدوات والتحكم المباشر في المضخة. وتسجيل البيانات من خلال النقر على التحكم المباشر في أداة SPR.

وفي كل مرة ، ابدأ في النافذة التي تظهر حديثا. بعد إضافة كواشف التوصيل في قارورة 300 ميكرولتر ، ضعها في رفوف أخذ العينات الأوتوماتيكية وابدأ جدول التشغيل بالنقر فوق تشغيل. للتفاعل البسيط بين البروتين والبروتين ، بعد إعادة تعبئة المضخة بمعدل 25،000 ميكرولتر في الدقيقة ، قم بإجراء تعديل خط الأساس لمدة 30 ثانية.

اترك التعديل الأساسي اللاحق بالماء المقطر المزدوج لمدة 1.5 دقيقة قبل إخماد سطح الرقاقة المنشط بهيدروكلوريد إيثانولامين مولاري واحد ، درجة الحموضة 8.5. ثم قم بتبديل الأنابيب من جهاز أخذ العينات السائل إلى جهاز إزالة الغازات من الماء المقطر المزدوج إلى الزجاجة باستخدام HBS-EP + انقر فوق النموذج ، وقم بالتمرير لأسفل ، وقم بالتغيير إلى المعالجة اللاحقة بالنقر فوق وضع التشغيل هذا. ثم انقر فوق إضافة لتحديد منحنيات الربط التي تم إنشاؤها بمرور الوقت في النظام الأساسي للبيانات لكل خلية تدفق وقم بتصدير التراكب كملف تنظيف.

بعد ذلك ، انقر فوق ملف لفتح خيارات حفظ الملف والحصول على منحنيات الاستجابة عن طريق محاذاة المنحنيات اليمنى واليسرى وطرح إشارات القناة المرجعية الثانية من تلك الخاصة بقناة الرباط. تم اختبار الحقن المفردة ل CVN2L0 والتباين V2 و V5 لأول مرة للارتباط برقاقة المستشعر المقترنة بالهيماجلوتينين لتقدير قدرات الربط باستخدام أخذ العينات الأوتوماتيكي ومحرر الجدول قيد التشغيل. تم أتمتة الحقن المتكرر بتركيزات مختلفة في النطاق النانوي والميكرومولي في النظام بمرور الوقت مما يدل على عدم تحقيق أي تشبع على سطح الرقاقة أو ارتباط التوازن.

تم رسم التركيز مقابل الاستجابة لارتباط CVN من النوع البري ب RBD ، بافتراض استهداف محدد للكربوهيدرات المحفوظة المحتملة على الوحدة الفرعية RBD S1 ذات التقارب الأضعف مع وجود ثابت معدل تفكك يبلغ 260 ميكرومول. لم يعد مخطط التقارب نفسه لربط CVN2L0-V4 ب DM قابلا للتحليل بسبب استبدال روابط ثاني كبريتيد التي تتداخل مع الارتباط عالي التقارب مع الببتيدات الصغيرة الغليكوزيلاتية وتنتج استجابة أعلى من القيمة القصوى للاستجابة. يظهر الارتباط البري من النوع CVN ب RBD على SARS-CoV-2 الارتباط ببروتين S و RBD مع ثابت غضب تفكك يبلغ 18.6 ميكرومول و 260 ميكرومول ، على التوالي.

على الرغم من أن استجابة SPR لتركيزات التحليل تؤدي إلى وحدات استجابة عالية وحساسات SPR نموذجية لربط CVN من النوع البري و E41A. ومع ذلك ، فإن المسخ غير مستقر عند تخفيفه. يعالج الاستشعار الحيوي SPR الارتباط عالي التقارب ومنخفض التقارب للبروتينات النقية ومتغيراتها بالروابط.

في حالتنا ، تستغل البروتينات السكرية القراءات البصرية ونظام التدفق ثنائي القناة على سطح رقاقة المستشعر. الإنزيم كونه مقايسة الممتز المناعي هو طرق مناعية بديلة تتعرف على حوائط البروتين ولكنها توفر أيضا بيانات عن تركيز الببتيدات والجزيئات الصغيرة من المصفوفات المعقدة. اختبار البروتينات المعبر عنها بشكل مؤتلف بواسطة مقايسات ربط SPR تضمنت الاستشعار الحيوي للتغيرات التأكيدية وهو أمر مفيد للتحقق والتنبؤ باستقرار البروتين من خلال جانب البروتين الحسابي.