تصوير الأنسجة متعددة الإرسال للغاية باستخدام أصباغ رامان

يوفر التصوير الاهتزازي متعدد الإرسال نهجا بصريا من طلقة واحدة لاستجواب علامات البروتين المتعددة في الأنسجة ذات الدقة دون الخلوية. توفر هذه المنصة صورة شاملة لتفاعلات البروتين في الأنظمة البيولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تعدد الإرسال الخالي من الدورات.

هذه التقنية مناسبة بشكل خاص للتطبيقات التي لا تعمل فيها استراتيجيات ركوب الدراجات بشكل جيد ، كما هو الحال في أقسام الأنسجة السميكة. تمكن هذه الطريقة من توصيف الخلايا الفردية في الموقع لفهم هياكل النظام المعقد ، مثل بناء أطلس الأنسجة ، والبيئات الدقيقة للورم الظاهري ، ودائرة الدماغ التنميط. للبدء ، قم بإعداد ما يقرب من 0.1 بيكربونات الصوديوم المولية في مخزن PBS المخزن المؤقت في PHA 0.3 لاستخدامها كمخزن مؤقت للاقتران وتخزينها عند أربع درجات مئوية.

ثم تحضير ثلاثة ملليمولار n-هيدروكسي سكسينيميد استر وظيفة MARS التحقيق الحل في ثنائي ميثيل السلفوكسيد اللامائي. قم بإذابة المواد الصلبة للأجسام المضادة في مخزن الاقتران العازل إلى تركيز ملليغرام لكل ملليلتر. بالنسبة للأجسام المضادة الذائبة في المخازن المؤقتة الأخرى ، ركزها في مرشح طرد مركزي ثم أضفها إلى مخزن الاقتران العازل إلى تركيز واحد إلى ملليغرام لكل ملليلتر.

لإجراء تفاعل الاقتران للأجسام المضادة الثانوية ، أضف 15 ضعفا من محلول الصبغة المولي إلى محلول الأجسام المضادة في قارورة زجاجية ببطء مع التحريك واحتضن خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة مع التحريك لمدة ساعة واحدة. لإجراء التنقية ، قم بإعداد الملاط عن طريق إضافة 10 ملليلتر من مسحوق راتنج ترشيح الجل إلى 40 ملليلتر من المخزن المؤقت PBS في أنبوب 50 ملليلتر. احتفظ بالمحلول في حمام مائي عند 90 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

ثم صب supernatant ، إضافة PBS تصل إلى 40 ملليلتر ، وتخزين الطين في أربع درجات مئوية. قم بتعبئة عمود استبعاد الحجم بمحلول الملاط على ارتفاع 10 إلى 15 سم ، ثم اشطف العمود واغسله بحوالي 10 ملليلتر من PBS لزيادة تعبئة الراتنج. بعد ذلك ، ماصة خليط تفاعل الاقتران إلى العمود.

بعد تحميل خليط التفاعل ، أضف على الفور ملليلتر واحد من PBS كمخزن مؤقت للاستخراج. بعد ذلك ، اجمع المحلول المقترن من خلال النظر إلى اللون الموجود على العمود أو عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر. باستخدام مرشح الطرد المركزي ، ركز المحلول الذي تم جمعه على واحد إلى ملليغرام لكل ملليلتر.

باستخدام قلم مسعور ، ارسم حدودا حول أقسام الأنسجة على الشريحة. ثم احتضن الأنسجة مع 0.3 إلى 0.5٪ PBST لمدة 10 دقائق ومخزن مؤقت مانع لمدة 30 دقيقة. لإعداد محلول التلطيخ الأساسي ، أضف جميع الأجسام المضادة الأولية إلى 200 إلى 500 ميكرولتر من مخزن التلطيخ المؤقت بالتركيزات المطلوبة.

الطرد المركزي لمحلول التلطيخ الأساسي في 13،000 مرة G لمدة خمس دقائق واستخدام supernatant إذا ظهر الراسب. ثم احتضن الأنسجة في محلول الأجسام المضادة الأولية عند أربع درجات مئوية لمدة يوم إلى يومين. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 0.3 إلى 0.5٪ PBST لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في جرة دائمة الانزلاق وتأكد من غمر الأنسجة في المحلول.

في وقت لاحق ، احتضن الأنسجة في 200 إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع لمدة 30 دقيقة. لإعداد محلول التلطيخ الثانوي ، أضف جميع الأجسام المضادة الثانوية إلى 200 إلى 500 ملليلتر من مخزن التلطيخ العازل بالتركيزات المطلوبة. ثم الطرد المركزي لمحلول التلطيخ الثانوي عند 13،000 مرة G لمدة خمس دقائق واستخدام supernatant إذا ظهر الراسب.

بعد ذلك ، احتضن الأنسجة في 200 إلى 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي عند أربع درجات مئوية لمدة يوم إلى يومين. ثم اغسل الشرائح مرتين بنسبة 0.3 إلى 0.5٪ PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل منها. علاوة على ذلك ، احتضن مع 200 إلى 500 ميكرولتر من محلول DAPI لمدة 30 دقيقة.

مرة أخرى ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل منها وانقل أقسام الأنسجة العائمة إلى الشرائح الزجاجية باستخدام ماصة إسقاط الزجاج. انشر الأنسجة بفرشاة مناديل ورقية ونظف المناطق المحيطة بها بمناديل مبللة إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، قم بتركيب الأنسجة في قطرة من الكواشف المضادة للتلاشي باستخدام غطاء زجاجي وقم بتثبيته باستخدام طلاء الأظافر.

لإجراء تصوير eprSRS متعدد القنوات ، اضبط طاقة الليزر لشعاع المضخة على 10 إلى 40 مللي واط وشعاع ستوكس على 40 إلى 80 مللي واط على لوحة التحكم بالليزر. ثم اضبط وقت سكن البكسل على اثنين إلى أربعة ميكروثانية واستخدم إطارات متعددة يبلغ متوسطها عادة من 10 إلى 20 إطارا على برنامج الفحص المجهري. علاوة على ذلك ، اضبط ثوابت الوقت الخاصة بمضخم القفل على نصف وقت سكن البكسل.

تم إجراء تصوير صبغة رامان لعلامات البروتين المميزة وخلايا HeLa شبه الفورمالديهايد الثابتة قشرة دماغ الفأر وأنسجة FFPE الرطبة في الكلى من خلال وضع العلامات المناعية. كشف التصوير المناعي لخلايا HeLa باستخدام ألفا توبولين عن هياكل دقيقة تحت الخلايا مثل الأنابيب الدقيقة. أظهر تصوير eprSRS للخلايا النجمية الملطخة MARS 2145 والخلايا العصبية الحبيبية المخيخية الملطخة MARS 2228 في أنسجة دماغ الفئران أنماطا ثلاثية الأبعاد بدقة دون الخلايا.

تم إجراء التصوير الترادف الفلوري SRS المكون من سبعة ألوان للهرمونات وعوامل النسخ على أنسجة جزيرة الفئران المجمدة. كشفت الصور التي تم الحصول عليها عن تباين جيد وأنماط صحيحة. تم إجراء التصوير الترادف الفلوري SRS المكون من ثمانية ألوان لعلامات نوع الخلية على أنسجة مخيخ الفئران الثابتة بارافورمالديهايد.

تم تحديد أنواع مختلفة من الخلايا مثل الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية ، والخلايا العصبية Purkinje ، والخلايا النجمية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا العصبية GABAergic. يمكن دمج هذا الإجراء بشكل أكبر مع إزالة الأنسجة لإجراء تصوير البروتين متعدد الإرسال للغاية في الأنسجة السميكة السليمة. طورت مجموعتنا بروتوكولا لمسح الأنسجة مصمم خصيصا لصبغة رامان لذلك.