تقييم الركيزة في كل مكان بواسطة E3 Ubiquitin-ligase في تحلل خلايا الثدييات

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الانتشار في كل مكان لركيزة معينة و E3 ubiquitin-ligase في خلايا الثدييات. تم استخدام خطوط الخلايا HEK293T للإفراط في التعبير عن البروتين ، وتم تنقية الركيزة متعددة التواجدات في كل مكان من تحلل الخلايا عن طريق الترسيب المناعي ، وتم حلها في SDS-PAGE. تم استخدام النشاف المناعي لتصور هذا التعديل بعد الترجمة.

يسمح هذا البروتوكول بتقييم انتشار ركيزة معينة في كل مكان بواسطة ليغاز E3. نحن نعلم أن توصيف تفاعل الركيزة الليغاز أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها في الخلايا. هذه التقنية لا تتطلب كواشف باهظة الثمن أو معدات متطورة.

يحتاج إلى البلازميدات وترميز الجينات ذات الأهمية ، وتطوير اختبار هطول الأمطار المناعي مع lysates الخلايا ، ولطخة غربية للكشف عن الركيزة في كل مكان. ترتبط العديد من الأمراض البشرية مثل السرطان والاضطرابات العصبية بعدم تنظيم E3 ligase. وبالتالي ، فإن تحديد انتشار الركيزة في كل مكان بواسطة ليغاز E3 محدد يمكن أن يساعد في علاج أو تشخيص تلك الأمراض.

إظهار الإجراء سيكون من قبل عيد الحب سباجنول. للبدء ، قم بزراعة خط الخلايا HEK293T إلى 80 إلى 90٪ التقاء في وسط Eagles المعدل من Dulbecco مع استكمال مصل البقر الجنيني بنسبة 10٪ و 100 وحدة من البنسلين و 100 ميكروغرام من الستربتومايسين و 0.292 ملليغرام لكل ملليلتر L-glutamine. ثم ، احتضن هذه الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.

قم بتمرير الخلايا عن طريق شفط الوسائط من طبق الثقافة باستخدام ماصة مصلية وغسلها مرة واحدة بملليلتر واحد من 1X PBS المعقمة. بعد ذلك ، افصل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد من محلول حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك التربسين وبعد خمس دقائق من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، أعد تعليق هذه الخلايا في ملليلترين من وسائط النمو باستخدام ماصة مصلية. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب جديد ونظيف سعة 15 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي بسرعة 500 مرة بوزن خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة supernatant بلطف وإعادة تعليق حبيبة الخلية في ثلاثة ملليلترات من وسائط النمو عن طريق السحب لأعلى ولأسفل للحصول على تعليق خلية متجانس. بعد ذلك ، انقل ملليلتر واحد من تعليق الخلية هذا إلى طبق استزراع معالج بتقنية TC بسعة 100 ملليمتر يحتوي على تسعة ملليلترات من وسائط النمو. قبل النقل ، قم بالتصديق على ما إذا كانت الخلايا خالية من التلوث وعند التقاء مناسب لعمليات النقل العابرة.

لكل عينة نقل ، قم بإعداد مجمعات الحمض النووي - البولي إيثيلين ينيمين عن طريق تخفيف ثلاثة ميكروغرام من كل بلازميد في 100 ميكرولتر من وسط المصل المخفض Opti-MEM 1 دون مكملات وخلطه بلطف عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، قم بإذابة الحمض النووي - البولي إيثيلين نيمين في درجة حرارة الغرفة وأضفه إلى المحلول بعد نسبة ثلاثة ميكرولترات من الحمض النووي - بولي إيثيلين نيمين لكل ميكروغرام واحد من الحمض النووي. تجانس الحل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.

ثم ، احتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين مجمعات الحمض النووي - البولي إيثيلين يمين. أضف الحجم الإجمالي لمجمعات الحمض النووي والبولي إيثيلين يمين إلى كل طبق يحتوي على مزرعة الخلايا واخلطها بلطف عن طريق هز الطبق ذهابا وإيابا. ثم ، احتضن هذه الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة.

بعد الحضانة وقبل ست ساعات من تحلل الخلايا ، عالج الخلايا المنقولة بمثبط بروتيازوم 10 ميكرومولار MG132 واحتضن الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة. بعد ذلك ، قم بشفط الوسائط من كل طبق استزراع باستخدام ماصة مصلية واغسل الخلايا مرة واحدة بملليلتر واحد من 1X PBS. ثم افصل الخلايا بإضافة ملليلتر واحد من التربسين واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسائط النمو وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب دقيق جديد ونظيف بسعة ملليلتر وقم بطرده مركزيا بسرعة 500 مرة بوزن G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الفائقة عن طريق سكبها بعناية وإعادة تعليق حبيبة الخلية بلطف في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل MP40 البارد المثلج مع كوكتيل مثبطات البروتياز والفوسفاتيز. ثم انقل هذا المحلول إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 1.5 ملليلتر.

احتضن هذه الخلية لمدة 30 دقيقة على الجليد ، وبعد الحضانة ، قم بطرد مركزي تحلل الخلية عند 16،900 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. وفي الوقت نفسه ، قم بموازنة حبات الأغاروز المضادة ل HA مع المخزن المؤقت لتحلل MP40 البارد على الجليد. استخدم 15 ميكرولتر من حبات الأغاروز المضادة ل HA لكل عينة.

اغسل الخرز ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل MP40 عن طريق نبضها في أنبوب طرد مركزي صغير عند 3000 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بشفط والتخلص من supernatant بعناية باستخدام ماصة وكرر هذه العملية ثلاث مرات. بعد ذلك ، حافظ على توازن الخرز على الثلج حتى الاستخدام.

بعد الطرد المركزي للخلايا ، قم باستعادة supernatant وتحديد محتوى البروتين في المحلول الكلي باستخدام طريقة برادفورد للتأكد من أن كل عينة معرضة لهطول الأمطار المناعية تقدم كمية متساوية من البروتين. احتضن الحجم اللازم من الخلية المحللة مع حبات الأغاروز المتوازنة المضادة ل HA لمدة أربع ساعات ، مع الدوران بلطف في حاضنة دوارة عند أربع درجات مئوية ، مما يسمح ل UXT-V2-HA بالارتباط بحبات الأغاروز المضادة لل HA. اجمع حبات الأغاروز المضادة للحمض الوراثي عن طريق نبضها في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق عند 3000 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية.

استنشق بعناية وتخلص من supernatant. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت لتحلل الخلايا MP40 البارد ومرتين باستخدام المخزن المؤقت FLAG HA البارد على الجليد. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة جميع المواد الفائقة بعناية باستخدام ماصة وقم بالتخلص من البروتين متعدد الكل مع 300 ميكروغرام لكل ملليلتر من ببتيد HA المخفف على المخزن المؤقت FLAG HA.

احتضن حبات الأغاروز المضادة ل HA مع ببتيد HA لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في منصة اهتزاز هزازة. بعد ذلك ، قم بتدوير الخرز عند 3000 مرة من G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة supernatant الذي يحتوي على البروتينات متعددة في كل مكان بعناية. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين العطر في أنبوب دقيق طازج ونظيف عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

حل eluents وتحلل الخلايا في 10 ٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد هلام الكهربائي الكهربائي والنشاف المناعي. لإجراء عملية نقل رطبة غربية ، ضع الجل في شطيرة نقل تتكون من ورق ترشيح ، ورق ترشيح غشاء هلام ، ووساده بمنصات ، واضغط عليه معا بواسطة شبكة دعم. ثم ضع هذا النظام عموديا في خزان مملوء بمخزن مؤقت للنقل بين أقطاب الأسلاك الفولاذية المقاومة للصدأ أو الأسلاك البلاتينية.

يحدث النقل لمدة 90 دقيقة عند 150 فولت في مخزن مؤقت للنقل الرطب. أخيرا ، قم بفحص غشاء اللطخة المناعية باستخدام الأجسام المضادة المضادة للفطريات. لوحظ تعدد الكل المحدد ل UXT-V2-HA بوساطة بروتين F-box 7 في الخلايا بعد فحص التسرب المناعي المضاد ل HA باستخدام جسم مضاد مضاد للفطريات ، والذي يكتشف myc-ub المترافق مع الركيزة.

تم تصور خصوصية مضاد المسك للركيزة متعددة التواجدات في كل مكان في الحارتين الأولى والثانية ، حيث لم يتم الكشف عن لطخة من البروتينات متعددة في كل مكان عندما تم نقل الخلايا بشكل مشترك مع بروتين F-box 7 و myc-ub في غياب بلازميد UXT-V2-HA. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم تصور أي لطاخة مقابلة لبروتين poly-ubiquitination في مزيج من بروتين F-box 7 و UXT-V2-HA بدون بلازميد myc-ub. عندما تم نقل بروتين F-box 7 الفارغ من النوع البري الناقل 7 أو بروتين F-box 7 غير قادر على تجميع SCF النشط في تركيبة مع UXT-V2-HA و myc-ub ، لوحظت إشارة تشويه قوية ل UXT-V2 متعدد التواجد-في كل مكان فقط لبروتين F-box 7 من النوع البري ، مما يشير إلى أن UXT-V2 كان متعدد الانتشار بواسطة مركب SCF F-box 7 والخلايا مقارنة بالضوابط.

خطوات هطول الأمطار الأحادي ، بما في ذلك حضانة التحلل الخلوي مع الخرز المتوازن وإزالة البروتينات المناعية المترسبة ضرورية لتحقيق هدف هذا البروتوكول. بعد هذا الإجراء ، يجب إجراء فحص في كل مكان في المختبر لتأكيد خصوصية الركيزة في كل مكان بواسطة الليغاز E3.