التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت

مرحباً، اسمي ليندا وأعمل في مختبر الدكتور إدوين نيكي بجامعة كاليفورنيا إيرفاين. سأوضح لكم اليوم كيفية استخدام مجموعة Sigma's Cyber Green لـ extracting a tissue PCR kit من أجل التنميط الجيني السريع للفئران المعدلة وراثياً. عادةً ما أستخدم هذه المجموعة لإجراء التنميط الجيني لفئراننا الجنينية عندما أقوم بعمل مزارع خلوية تفكيكية حادة وأحتاج إلى معرفة النمط الجيني للفأر بسرعة فائقة.

ولكن لأغراض اليوم، لدينا ذيول فئران بالغة يمكننا من خلالها أن نوضح لكم كيفية استخدام هذه المجموعة. يتضمن هذا البروتوكول عملية هضم سريعة باستخدام الـ ale واستخلاصاً للحمض النووي DNA، ثم خطوة تعادل سريعة. ونستخدم الـ DNA المستخلص في تفاعل PCR في الوقت الحقيقي، حيث يمكننا مراقبة نواتج تضخيم الـ PCR.

إذا كنتم مستعدين، فلنبدأ. قبل البدء، نريد التأكد من ضبط الكتلة الحرارية على 95 درجة Celsius، وأن صبغة cyber green قد ذابت وتُحفظ على الثلج حتى وقت استخدامها، وأن الكواشف الأخرى تذوب لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. يوجد في دلو الثلج الخاص بي البادئان اللذان سنستخدمهما للتنميط الجيني، وقد تم تصميمهما خصيصاً للجين المستهدف والتحقق من كفاءتهما في QPCR.

لدي أيضاً الضابط الموجب للجين المستهدف والضابط السالب وعينة نسيجية قمت بجمعها مسبقاً من فأر بالغ. والآن، عند جمع عينة النسيج، من المهم جداً توخي الدقة الشديدة؛ فعندما نجمع الذيول الجنينية للفئران، نقوم دائماً بشطف الملاقط بـ 70% ethanol قبل وأثناء كل عملية جمع للأنسجة.

نقوم دائماً بشطف عينات الذيل في محلول TBS أولاً، ثم يجب تحضير مزيج رئيسي (master mix) لتحضير الأنسجة واستخلاص DNA لكل ذيل، حيث ستحتاج إلى 100 µL من محلول الاستخلاص و25 µL من محلول تحضير الأنسجة. سأستخدم الماصة P 200 ورؤوس ماصة مزودة بمرشح لقياس 100 µL من محلول الاستخلاص و25 µL من محلول تحضير الأنسجة في أنبوب eppendorf جديد. بعد ذلك، قم بخلط محلول المزيج الرئيسي عن طريق السحب والدفع بالماصة.

وبناءً على ذلك، ستحتاج إلى إضافة 125 µL من المزيج الرئيسي (master mix) إلى العينة المراد دراستها، مع التأكد من أن الطرف المقطوع مغمور تماماً في محلول المزيج الرئيسي إذا كانت العينة عبارة عن ذيل فأر بالغ، ويمكنك بعدها رج العينة برفق باستخدام الأصابع (finger vortex) ثم تحضينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وأثناء فترة التحضين التي تستغرق 10 دقائق، سأقوم بتحضير المزيج الرئيسي الأخضر المفضل لدي، والذي يتكون من المزيج الرئيسي cider green المرفق في المجموعة، ومياه Milli Q أو مياه مخصصة لـ PCR، والبادئات الخاصة بنا، حيث يتم خلط مياه PCR مع البادئات الأمامية والعكسية. وهذا كل شيء.

بعد انتهاء فترة الحضانة التي استغرقت 10 دقائق، سنقوم بتسخين وتنشيط التفاعل عند 95 درجة لمدة ثلاث دقائق. لقد انتهت فترة التعطيل التي استغرقت ثلاث دقائق، والآن سنضيف محلول التعادل المرفق في الطقم، حيث سنضيف 100 µL لكل تفاعل، ثم نقوم بخلط هذا المزيج باستخدام جهاز Vortex. بعد إضافة منظم التعادل، يمكن تخزين عينات DNA عند 4 درجة Celsius حتى يحين وقت استخدامها.

نحن نرغب في الحصول على النمط الجيني على الفور، لذا سننتقل مباشرة إلى عملية الـ QPCR، حيث تم تحييد العينات الموجودة في الأنابيب وأصبحت جاهزة. كما أن خليط الـ Cyber Green PCR master mix جاهز، وقد قمت بتجهيز أنابيب الـ PCR على كتلة تبريد.

كل ما سأفعله الآن هو إضافة 16 µL من المزيج الرئيسي (master mix) إلى كل بئر، ثم إضافة 4 µL من المستخلص المعاد تعاديله أو 4 µL من الضابط الموجب أو السالب إلى كل منها. سأقوم بإضافة 16 µL من المزيج الرئيسي إلى كل بئر. بعد ذلك، سأضيف 4 µL من المستخلص المعاد تعاديله إلى 16 µL من المزيج الرئيسي في البئر، ليكون إجمالي حجم التفاعل 20 µL.

وسأقوم بنفس الإجراء بالنسبة للضوابط الموجبة والسالبة، وذلك بإضافة 4 µL إلى 16 µL من المزيج الرئيسي PPR master mix. وبمجرد إضافة جميع المكونات، يمكنك إغلاقها باستخدام شريط أغطية ثماني شفاف بصرياً.

يجب الحرص على عدم لمس الجزء الشفاف بصرياً من الأغطية الموجودة فوق العينات. لذا، أنا أستخدم مناديل Kim wipe للضغط على الأغطية للتأكد من إحكام إغلاقها. لقد قمت برجّ خليط الـ PCR والـ DNA بلطف باستخدام جهاز vortex ثم قمت بطردهم بالتنظيم المركزي (spun them down)، ونحن الآن مستعدون لوضعهم في جهاز QPCR.

سنقوم أولاً بتحميل العينات في جهاز Opticon PCR، وسأقوم بإعداد لوحة جديدة، حيث ستكون البئر الأولى للعينات، والبئر الثانية للضابط الموجب، والبئر الثالثة للضابط السالب، مع تحديد أن الحجم الإجمالي للتفاعل هو 20 µL. بعد ذلك، سأقوم بتحميل بروتوكول مصمم لعملية التنميط الجيني السريع.

يتضمن هذا البروتوكول خطوة مسخ لمدة ثلاث دقائق، ودورة تتكون من 15 ثانية من المسخ، و15 ثانية من الارتباط الأولي، ثم 20 ثانية من التمديد الأولي. ويمكن في الواقع خفض زمن التمديد الأولي إلى حوالي 10 ثوانٍ، وبذلك يصبح المجموع 40 ثانية فقط. وفي كل دورة، تتكرر هذه الخطوات الثلاث حوالي 40 مرة كما هو الحال في تفاعل PCR العادي، وفي نهاية ذلك نقوم بإجراء منحنى الانصهار.

لقد انتهينا من تجهيز الطبق وتحميل البروتوكول. كل ما علينا فعله الآن هو تشغيل جهاز QPCR، والذي سيبدأ بمرحلة المسخ لمدة ثلاث دقائق. ومن خلال خبرتي، وبالاعتماد على البادئات التي أستخدمها وعينات الذيل والبحث عن الجينات المستهدفة، أعلم أن العينات الإيجابية ستبدأ في الظهور عند حوالي 25 دورة، متجاوزة عتبة الدورة ذات الدلالة الإحصائية.

الآن، يعتمد توقيت هذا التقاطع بشكل كبير على عينة النسيج لديك، وما تبحث عنه، وكمية DNA الموجودة في البداية. لذا يمكننا أن نرى بالفعل أن الضابط الموجب قد ظهر بالفعل، ويبدو أن عينتنا موجبة أيضاً. كما تلاحظون، بدأت تظهر قليلاً بعد الضابط الموجب.

سيتعين علينا الانتظار لفترة أطول لأننا لا نزال عند الدورة 27، ولكن من المؤمل في غضون دورتين إضافيتين أن نتأكد من أن عينتنا إيجابية، وعندها يمكنني المضي قدماً في تجربتي. في هذه المرحلة، يمكنك رؤية الضابط السلبي يبدأ في الظهور، وذلك لأنني استخدمت كمية زائدة من الذيل. يساعدك ذلك على التأكد من أن أي شيء يظهر قبل هذا الذيل السلبي الزائد سيكون إيجابياً.

لذلك، في هذه المرحلة، سأعتبر أي نتيجة تظهر قبل العينة السالبة نتيجة موجبة، وسأواصل تجربتي. وبعد انتهاء دورات PCR، يقوم الجهاز بإجراء تحليل منحنى الانصهار، وهو ما سيساعدك في تحديد تركيب ونقاء المنتج الخاص بك.

بهذه الطريقة، يمكنك معرفة ما إذا كنت قد اخترت العينات الموجبة والسالبة بشكل صحيح. على سبيل المثال، ستظهر العينة الموجبة قمة حادة ومحددة لدرجة حرارة الانصهار، والتي تقابل تضاعف منتج PCR محدد. أما أي عينات سالبة فستظهر قمة عريضة وغير محددة لدرجة حرارة الانصهار، وهو ما يشير إلى تضاعف DNA غير محدد خلال عملية PCR.

لقد أوضحتُ لكم للتو كيف نستخدم مجموعة استخلاص Cyber Green من شركة Sigma لإجراء التنميط الجيني السريع لذيول الفئران البالغة. ولكن يمكن استخدام هذه المجموعة مع أنسجة حيوانية متنوعة، والشعر، واللعاب، كما أنني أستخدمها لإجراء التنميط الجيني لذيول الأجنة في الفئران. نحن نفضل استخدام هذه المجموعة نظراً لسرعتها.

يمكنني الحصول على نمطي الجيني في غضون ساعة واحدة، وهو أمر مريح وبسيط للغاية. لذا، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق.