إعداد وتوصيف الحبر الحيوي الهجين الحيوي 3D القائم على الجرافين للهندسة العصبية الطرفية

نظام الخلايا الجذعية تحت تأثير مكوناته الهامة. لا يمكن تصور الحفاظ على الخلايا الجذعية وتمييزها دون وجود بيئتها المكروية. تتكون هذه البيئة المكروية ، التي تسمى مكانة الخلايا الجذعية ، من الخلايا والسقالات.

يمكن أن يكون الاعتلال العصبي المحيطي وأحيانا ، قد يكون مثل إصابة الضفيرة العضدية ، والصدمات المختلفة ، والورم ، والتشوهات اللاإرادية ، والتعريف المناعي ، وأمراض التمثيل الغذائي. وقد تم تطوير أساليب ثقافة 3D مختلفة لتوفير مكانة أفضل وأكثر طبيعية للخلايا الجذعية. تشكيل كروي والطباعة الحيوية 3D هي طرق جديدة وواعدة نسبيا للثقافات 3D.

يمكن أيضا استخدام الطباعة الحيوية 3D في دراسات الهندسة العصبية. وبالتالي ، في هذه الدراسة ، تم تطوير الأحبار الحيوية القائمة على الجرافين والجينات / الجيلاتين ودراستها لخصائصها التجديدية. للبدء ، قم بزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية من وارتون أو WJMSCs في وسط DMEM F12 الذي يحتوي على 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية أو FBS ، و 1٪ قلم / بكتيريا ، و 1٪ L-glutamine تحت تدفق رقائقي معقم في درجة حرارة الغرفة.

عندما تكون الخلايا المستزرعة متقاربة بنسبة 80٪ في القارورة ، صب الوسط واغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم أضف خمسة ملليلتر من 0.25٪ تربسين و 2.21 مليمول صوديوم EDTA واحتضانها عند 37 درجة مئوية. بعد خمس دقائق ، أضف 10 ملليلتر من وسط DMEM F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى الخلايا.

تعليق الخلايا ، وجمع الوسيط ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا وتخلص من المادة الطافية قبل إعادة زرع الخلايا في قارورة جديدة بوسط مغذي طازج يحتوي على 10٪ FBS. لتحضير الحبر الحيوي لمجموعة التحكم بدون الجرافين ، قم بوزن 4.5 ملليغرام من الجينات و 1.5 ملليغرام من الجيلاتين ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي.

ثم أضف 50 ملليلتر من وسط DMEM F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى الأنبوب. مرة أخرى ، تزن 4.5 ملليغرام من الجينات و 1.5 ملليغرام من الجيلاتين ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي. ثم أضف 50 ميكرولترا من 0.1٪ جرافين إلى الأنبوب واجعل الحجم 50 ملليلتر باستخدام وسط DMEM F12 يحتوي على 10٪ FBS.

امزج الأحبار الحيوية عن طريق السحب والدوامة قبل التعقيم عند 121 درجة مئوية تحت 1.5. الضغط الجوي لمدة 20 دقيقة. بعد التعقيم ، قم بالطرد المركزي المحلول لإزالة الفقاعات المشكلة ووضع الأحبار الحيوية عند 37 درجة مئوية حتى يتم تحضير الخلايا.

لتفاعل الحبر الحيوي الخلوي، قم بإنشاء مجموعات الحبر الحيوي. تتضمن المجموعة الأولى 3D-B و 3D-G مطبوعة بالحبر الحيوي للطباعة الحيوية. تتضمن المجموعة الثانية الأحبار الحيوية 3D-BS و 3D-GS التي تشكلت عليها كرويات بعد الطباعة الحيوية.

بالنسبة إلى المجموعة الأولى، عد الخلايا إلى واحد في 10 أس الخلايا السابعة في 0.5 ملليلتر من الوسط. ثم أضف 4.5 ملليلتر من الحبر الحيوي. انقل الخليط إلى الخراطيش الموجودة في الخزانة المعقمة باستخدام المحاقن.

قم بتثبيت الخراطيش في قسم الطارد المقابل في الطابعة الحيوية. بالنسبة للمجموعة الثانية ، خذ خمسة ملليلتر من الحبر الحيوي من كل مجموعة من مجموعات الحبر الحيوي وانقلها إلى خراطيش معقمة بمساعدة حاقن. استخدم الطابعة الحيوية مع رأسي طباعة متحدي المحور وتقنية البثق التي تعمل بالهواء المضغوط.

اضبط دقة XYZ لكل خطوة صغيرة على 1.25 ميكرومتر ، وعرض البثق على 400 ميكرومتر ، وارتفاع البثق على 200 ميكرومتر. استخدم شبكة 20 × 20 × 5 ملم لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد. إنشاء نماذج 3D باستخدام برامج CAD مفتوحة المصدر على شبكة الإنترنت.

بالنسبة لعملية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، اضبط متوسط ضغط الطابعة على 7.5 رطل / بوصة مربعة. ثم اضبط الخرطوشة ودرجة حرارة السرير على 37 درجة مئوية والسرعة على 60٪ ضع النظام في وضع المنزل أثناء مرحلة الكتابة. ضع المحاور تلقائيا وحدد الطارد واضبطه قبل بدء عملية الطباعة الحيوية.

بعد الطباعة ، قم بإزالة العينة ووضعها تحت خزانة التدفق الصفحي. بعد ذلك ، قم برش الأحبار الحيوية بمحلول كلوريد الكالسيوم العادي 0.1 أو أضف محلول ملليلتر واحد مع ماصة في درجة حرارة الغرفة وانتظر لمدة 10 إلى 20 ثانية. ثم اغسل الأنماط المطبوعة مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.

أضف ملليلتر من وسط DMEM F12 مع 10٪ FBS فوق كل خلية تحتوي على مجموعة حبر حيوي واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من وسط التعليق الذي يحتوي على واحد × 10 إلى الخلايا السادسة لكل مجموعة واحتضان الألواح. بعد 24 ساعة ، راقب وصور جميع دفعات الحبر الحيوي لتشكيل كروي تحت مجهر مقلوب لتمايز WJMSCs إلى خلايا شبيهة بالخلايا العصبية باستثناء المجموعة الضابطة.

أضف ملليلتر من وسط التمايز العصبي لكل بئر وقم بالتحديث كل يومين. اتبع لمدة سبعة أيام لمراقبة التمايز العصبي. بعد ذلك ، باستخدام التصوير الفاصل الزمني ، افحص آثار الجرافين على الخلايا الجذعية وراقب تفاعلات الخلايا داخل الحبر الحيوي.

يوضح هنا تأثير تركيز الجرافين على تكاثر الخلايا. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، لوحظ انخفاض معنوي لتركيز الجرافين 0.001٪. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات الأخرى والسيطرة.

أظهرت تفاعلات الجرافين الخلوي أن الجرافين تم تحمله في نظام 2D وتم أخذه من قبل الخلايا من خلال التداخل الخلوي. أظهر التصوير الفاصل الزمني أن الخلايا التي نجت في وسط الجرافين 3D حافظت على حيويتها من خلال سطوع GFP حتى نهاية الحضانة. يتم عرض صور SEM وتحليل FIIR لمجموعات الحبر الحيوي 3D-B و 3D-G هنا.

تم عرض تفاعلات خلايا الحبر الحيوي على السطح وداخليا. كانت الخلايا مستديرة شكليا ومتصلة بالمادة. في التمايز العصبي 3D ، اعتبر أن حدود الخلايا الكروية في كلا المجموعتين كانت شفافة وحيوية ، وكانت الكرويات في مجموعة الجرافين أكبر نسبيا وحاصرت الجرافين داخل الخلية.

يظهر هنا التلوين المناعي للخلايا 2D و 3D. تمثل الصور الخضراء تراكيب شبيهة بالخلايا العصبية. عبرت عينة التحكم الإيجابية 2D عن عدد أقل من علامات البنية الشبيهة بالخلايا العصبية من عينات 3D.

اكتشفنا أن الأحبار الحيوية القائمة على الجرافين كانت أكثر نجاحا من حيث تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا شبيهة بالخلايا العصبية. نقترح أن الأحبار الحيوية القائمة على الجرافين ستكون أدوات ممتازة لعلاج اضطرابات الأعصاب الطرفية في مزيد من الدراسات. اليوم ، يمكن إنشاء نظام الخلايا الجذعية عن طريق هندسة الأنسجة باستخدام المواد الحيوية الطبيعية والاصطناعية يتم توفير إنشاء أنسجة اصطناعية يمكن أن تحل محل الأنسجة الحية التي يمكن استخدامها في تجديد هذه الأنسجة ، وإزالة الضرر ، وتوفير الوظيفة من خلال هندسة الأنسجة.