تحليل ديناميكيات الميكروبات البرازية في الفئران المعرضة لمرض الذئبة باستخدام طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي
مايو 2, 2022
يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي لتحليل تغيرات ميكروبات الأمعاء الفئرانية أثناء تطور أمراض المناعة الذاتية.
يمكن أن تعمل طريقة عزل الحمض النووي المقترحة على دراسة ديناميكيات ميكروبات الأمعاء في نماذج الفئران الخاصة بأمراض المناعة الذاتية. يقترح استخدام طريقة أكثر تنوعا وفعالية من حيث التكلفة وكفاءة للحصول على الحمض النووي من عينات البراز التي يمكن مقارنتها بالمجموعات المتاحة تجاريا. للبدء ، خذ كل فأر على حدة من قفصه ، وجمع حبيبة براز مباشرة من فتحة الشرج وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تتم معالجتها.
قم بمعالجة العينات باستخدام ملقط وأنابيب وقفازات معقمة ونظيفة. أضف حبيبة مجمدة إلى أنبوب غطاء لولبي بسعة ملليلتر تم وزنه مسبقا ، وسجل وزن البراز بالجرام ، والذي يجب أن يتراوح بين 0.02 إلى 0.05 جرام لكل حبيبة برازية. أضف إلى الكريات طبقة رقيقة من الخرز الزجاجي 0.1 ملم ، و 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، و 200 ميكرولتر من كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 20٪.
ضربت حبة الأنبوب لمدة أربع دقائق في مجانس ، تليها ثلاث إلى خمس دقائق من الدوامة. الطرد المركزي للأنابيب لفترة قصيرة للقضاء على الفقاعات والرغوة. لاستخراج الحمض النووي من عينات الميكروبات ، انقل 350 ميكرولتر من العينة الفائقة إلى أنبوب غطاء جديد ، 1.5 ملليلتر ، دون أي حطام.
أضف 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل، بنسبة 25:24:1، والدوامة لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي ، انقل 180 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا إلى أنبوب غطاء جديد بسعة 1.5 ملليلتر. أضف 180 ميكرولتر من الكلوروفورم ، وقلبها واخلطها.
من هذا ، انقل 180 ميكرولتر من المرحلة المائية إلى أنبوب غطاء مفاجئ جديد. في خزانة السلامة الأحيائية ، أضف 180 ميكرولتر من الأيزوبروبانول البارد و 36 ميكرولتر من خمسة أسيتات أمونيوم مولار. قلبه عدة مرات للخلط ، وضع الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة.
تخلص من السوبرناتانت ، متبوعا بغسل الكريات عدة مرات ب 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 70٪. تخلص من السوبرناتانت ، وجفف الأنبوب رأسا على عقب رأسا على عقب على المناديل الورقية لمدة 20 دقيقة ، حتى تصبح الكريات واضحة. الكريات في 50 ميكرولتر من الماء الجزيئي ، وقم بتسخين السائل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإذابة كريات الحمض النووي الكبيرة بالكامل.
بعد التسخين ، قم بطرد مركزي هذه الأنابيب عند 3،400 مرة G لمدة دقيقة واحدة لاستعادة قطرات التكثيف من الغطاء. قياس التركيز، والحصول على نسبة 260/280 باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تتراوح نسبة الحمض النووي عالي الجودة بشكل عام بين 1.8 واثنين.
الطرد المركزي للعينات المحضرة بسرعة 600 مرة G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، قبل التجمد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة. ثم أرسل 20 ميكرولترا من العينات بتركيزات تتراوح من واحد إلى 50 نانوغرام لكل ميكرولتر إلى مختبر أرغون الوطني للتسلسل. تحتوي سلالة الفئران التي تفتقر إلى المستقبل CX3CR1 على تركيبة ميكروبات معوية مختلفة مقارنة بالفئران MRL / lpr من النوع البري ، MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP ، اختلافات كبيرة في أجناس معينة ، ذات صلة بالبكتيريا المسببة للأمراض المحتملة مثل تلك الموجودة في البكتيريا البروتينية.
كن حذرا في تلويث العينة. يجب أن تكون معقمة. أيضا ، من المهم سحب السحب بدقة عند نقل supernatant في أنبوب جديد.
هذه الطريقة مناسبة للتحليل الجزيئي مثل PCR أو هضم إنزيم التقييد أو بناء مكتبة الجينوم. في مرض الذئبة ، أثبتنا وجود علاقة قوية بين ميكروبات الأمعاء وتطور مرض الذئبة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل DNA من أجل تحليل التغيرات في ميكروبيوم الأمعاء لدى الفئران أثناء تطور مرض مناعي ذاتي. وقد صُممت هذه الطريقة لدراسة ديناميكيات ميكروبيوم الأمعاء في نماذج الفئران المصابة بأمراض المناعة الذاتية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء الدقيقة
- المناعة الذاتية
خلفية علمية
- يعد فهم ميكروبيوتا الأمعاء أمراً بالغ الأهمية في أبحاث أمراض المناعة الذاتية.
- يمكن أن تكون الطرق الحالية لعزل DNA مكلفة ومعقدة.
- تقترح هذه الدراسة بديلاً أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة.
- تُستخدم عينات البراز لتحليل التغيرات في الميكروبيوتا.
الغرض من الدراسة
- توفير طريقة موثوقة لاستخلاص DNA من عينات البراز.
- تسهيل دراسة ميكروبيوم الأمعاء في نماذج أمراض المناعة الذاتية.
- مقارنة كفاءة الطريقة الجديدة مع المجموعات التجارية المتاحة.
الطرق المستخدمة
- جمع حبيبات البراز بشكل فردي من الفئران.
- تخزين العينات عند درجة حرارة -80 °C.
- استخدام أدوات معقمة لمعالجة العينات.
- تحضير العينات باستخدام محلول التحلل (lysis buffer) وحبيبات زجاجية.
النتائج الرئيسية
- تنتج الطريقة المقترحة حمضاً نووياً (DNA) بجودة تضاهي تلك التي توفرها المجموعات التجارية.
- تتميز الطريقة بكونها فعالة من حيث التكلفة والكفاءة لتحليل الميكروبيوم.
- تسهل هذه الطريقة إجراء المزيد من الأبحاث حول آليات أمراض المناعة الذاتية.
الاستنتاجات
- تُعد طريقة عزل DNA هذه أداة قيمة للباحثين.
- فهي تدعم استقصاء ميكروبيوم الأمعاء في سياقات المرض.
- وتشجع على إجراء أبحاث أكثر تيسيراً في مجال المناعة الذاتية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد التحليل الموثوق لديناميكيات ميكروبات الأمعاء في نماذج أمراض المناعة الذاتية أمراً بالغ الأهمية لفهم المساهمات البيئية والجينية في تطور المرض. يتيح بروتوكول عزل الـ DNA منخفض التكلفة هذا استخلاصاً قابلاً للتوسع والتكرار للـ DNA الميكروبي من عينات براز الفئران، مما يدعم دراسات الميكروبيوم عالية الإنتاجية في الأبحاث قبل السريرية. وتعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في ربط تحولات الميكروبات بالأنماط الظاهرية للمناعة الذاتية، مما يوجه استراتيجيات الاكتشاف المبكر والترجمة السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاء التفاعلات بين الميكروبيوتا والجهاز المناعي في نماذج الفئران ذات الصلة بالمرض.
- يدعم التحقق الوظيفي من المسارات المرشحة التي تتأثر بتكوين الميكروبات المعوية.
- يسهل عملية تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال ربط التحولات الميكروبية بتطور الأمراض المناعية الذاتية.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر عينات DNA موحدة وقابلة للتكرار لعمليات التسلسل والمقاييس الجزيئية اللاحقة.
- يضمن الحصول على DNA كمي وعالي الجودة ومناسب لسير عمل PCR وتسلسل الجيل القادم.
- يتيح معالجة العينات بشكل قابل للتوسع لإجراء دراسات الميكروبيوم المقارنة عبر المجموعات التجريبية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط التوصيف المسبق للسريرية للميكروبيوتا مع تطور المرض وجهود اكتشاف المؤشرات الحيوية.
- يدعم الاستمرارية من نتائج مرحلة الاكتشاف إلى التحقق الانتقالي في نماذج أمراض المناعة الذاتية.
- يقلل من الغموض البيولوجي في ربط المحفزات البيئية بالأنماط الظاهرية للمرض.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
يتناسب بروتوكول عزل DNA هذا ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف المبكر إلى الدراسات قبل السريرية، مما يتيح تحليلاً قوياً للميكروبيوم في نماذج الفئران المعرضة للإصابة بالذئبة، ويدعم تحديد المركبات الواعدة والدراسات الميكانيكية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات حول التعديل المناعي الذي تحفزه الميكروبيوتا في أمراض المناعة الذاتية.
- الفحص: توفر مخرجات DNA كمية وقابلة للتكرار من أجل توصيف الميكروبيوما القائم على التسلسل.
- التحليلات: توفر مدخلات عالية الجودة للمقارنة الإحصائية لتحولات المجتمع الميكروبي بين الأنماط الجينية أو العلاجات.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج الميكروبيوما قبل السريرية بالتطوير المحتمل للمؤشرات الحيوية في أمراض المناعة الذاتية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تقدم بروتوكولاً قابلاً للتوسع وفعالاً من حيث التكلفة وقابلاً للتكيف مع مختلف النماذج الفأرية والتصاميم التجريبية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في الارتباطات بين الميكروبيوتا والأمراض والتحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توحد عملية استخلاص DNA، مما يحسن من إمكانية التكرار وقابلية التوسع عبر الدراسات.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات مدروسة بالاستمرار أو التوقف من خلال توضيح مساهمات الميكروبيوم في آليات المرض.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للتدخلات المعدلة للميكروبيوم في مسارات تطوير علاجات أمراض المناعة الذاتية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة تقنية في التعامل مع العينات المعقمة وسير عمل البيولوجيا الجزيئية.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة التجانس، وأجهزة الطرد المركزي، وأجهزة القياس الطيفي للتحكم في الجودة.
- يتطلب توحيداً صارماً بين الفرق لتقليل التلوث والتباين.
- قابل للتكيف مع مختلف النماذج الفئرانية، ولكن قد يتطلب تحسيناً لأنواع العينات المختلفة.
- يعتمد على دقة السحب بالماصة والتقنية المعقمة لضمان سلامة البيانات.
