صياغة وتوصيف نظام ناقل الدوبامين القائم على الإكسوسوم

قد تتفاعل الإكسوسومات مع الحويصلات التي تفرزها خلية يتراوح حجمها بين 14 و 200 نانومتر ، وتنقسم من داخل الخلايا والاتصال ، والتي تأتي إلى أصغر مجموعة فرعية من الحويصلات خارج الخلية. Exosomes التي تتشكل نتيجة لتمايز endosome ، تنشأ من غشاء الخلية. يمكن عزل الخلايا الجذعية من مصادر مختلفة مثل نخاع العظم أو الأنسجة الدهنية.

لكن الخلايا الجذعية المجففة في الأنسجة البالغة لديها إمكانات مناعية أعلى سلبيات ينبثق حجم الإكسوسومات ، يقال إنه لعب دورا مهما في أمراض الجهاز العصبي المركزي لأنه يمكن أن يمر عبر حاجز الدم في الدماغ. للبدء ، اغسل الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية في وارتون بخمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم أضف خمسة ملليلتر من محلول التربسين EDTA قبل وضع القارورة في حاضنة.

بعد الحضانة ، اجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 1،500 غرام لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية وإضافة ملليلتر واحد من DMEM-F12 يحتوي على 10٪ FBS إلى الأنبوب. غسل الخلايا المستزرعة مع برنامج تلفزيوني.

بعد الغسيل ، أضف وسط DMEM-F12 الخالي من المصل إلى الخلايا وضعه في الحاضنة. لعزل الإكسوسومات ، اجمع الوسائط الخالية من المصل وأجهزة الطرد المركزي عند 300 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. نقل المادة الطافية إلى أنبوب آخر ومعالجتها عن طريق الطرد المركزي التسلسلي بسرعات أعلى.

بعد الطرد المركزي النهائي ، قم بإزالة المادة الطافية ببطء وقم بإذابة الحبيبات في ملليلتر واحد PBS. تخلط عن طريق الدوامة والمضي قدما في الطرد المركزي الفائق في 110،000 غرام لمدة 70 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أضف ثلاثة ملليلتر من PBS إلى التعليق الخارجي الذي تم جمعه مسبقا عن طريق الطرد المركزي الفائق وقم بتعقيم التعليق المخفف عن طريق الترشيح باستخدام مرشح 0.22 ميكرون.

ثم انقل 500 ميكرولتر من تعليق exosome المعقم إلى أنبوب آخر. بعد ذلك بالتتابع ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من محلول الدوبامين والصابونين في التعليق المعقم. بعد الحضانة ultracentrifuge التعليق.

يمكن استخدام العينة إما لتحليل NTA و DLS لتوصيف الإكسوسومات المحملة بالدوبامين أو تخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. في تحليل NTA ، تم تحديد متوسط حجم الإكسوسومات المشتقة من هلام وارتون ليكون 98 نانومتر والإكسوسومات المحملة بالدوبامين ليكون 110 نانومتر. كانت أعداد الجسيمات النانوية التي كشفت عنها تحليلات NTA و DLS متسقة مع بعضها البعض.

تم قياس إمكانات زيتا للإكسوسومات المشتقة من هلام وارتون على أنها ناقص 15.7 والإكسوسومات المحملة بالدوبامين على أنها ناقص 17.6 مللي فولت. كشف تحليل HPLC للإكسوسومات المحملة بالدوبامين عن ذروة الدوبامين في 6.45 دقيقة. كشف الملف التراكمي لإطلاق الدواء أن 74.8٪ من الدوبامين المغلف تم إطلاقه من الإكسوسومات خلال الساعات الثماني الأولى.

تم التحقيق في السمية الخلوية للدونوبامين المحملة والإكسوسومات الحرة على الخلايا الليفية. على الرغم من أن الإكسوسومات المحملة بالدوبامين لم تظهر أي تأثيرات سامة للخلايا ، إلا أن الصابونين قلل من صلاحية الخلايا الليفية. أظهر اختبار MTT زيادة في صلاحية الخلية عندما عولجت الخلايا الليفية بالإكسوسومات المحملة بالدوبامين.

تم تقييم الدلالة الإحصائية للنتائج من خلال إجراء anova أحادي الاتجاه. بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقيق في التأثيرات السامة للخلايا لتركيزات مختلفة من الإكسوسومات الحرة على الخلايا الليفية. كانت صلاحية الخلايا الليفية أعلى مع الإكسوسومات الحرة بتركيز 25 ميكرولتر لكل ملليلتر.

من المهم حقا بالنسبة للجهاز العصبي المركزي هو أحجام المرضى ، والدور الذي يلعب في عمليات مثل اللدونة ، والاستجابة العصبية ، والتواصل من جانب إلى جانب ، وتكوين الخلايا العصبية في الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، بفضل سطح exosomes ، كما تقول ، لوحظ أنها يمكن أن تتفاعل مع دواء الخلية المستهدفة والنشاط الذي يتم تسليمه أثناء الدواء هو الانتهاء. لأول مرة في الدراسة ، قمنا بتطوير تركيبة دوائية جديدة عن طريق تغليف الدوبامين في إكسوسومات مشتقة من الخلايا الجذعية.

واقترح أن هذه الصيغة ستكون واعدة جدا لعلاج مرض باركنسون.