التحليل الكمي للخصائص اللزجة المرنة لخلايا الدم الحمراء باستخدام ملاقط بصرية والفحص المجهري اللابؤري

تسمح هذه المنهجية باستكشاف السلوك الميكانيكي لكريات الدم الحمراء ، وتوصيف معلماتها اللزجة المرنة وخصائصها الزجاجية الناعمة للعديد من الحالات الفسيولوجية والمرضية. تتحقق طريقتنا القائمة على الخلية الواحدة من مراجع الفيديو باستخدام القيم المعدنية لعامل الشكل الذي يربط القوى والإزاحة والضغوط والخدوش في سطح كرات الدم الحمراء. ابدأ بصب شحم السيليكون على سطح الحلقة المطاطية بطريقة تغطي المحيط بأكمله.

بعد ذلك ، ضع الحلقة المطاطية على غطاء الغطاء بحيث يكون جانب الشحوم مواجها لقسيمة الغطاء. انتظر لمدة خمس دقائق للتعلق المناسب ، ومن ثم يكون حاملو العينات جاهزين لتلقي مزرعة الخلية. بعد ذلك ، مع حل الخلايا المعدة مسبقا باتباع البروتوكول المكتوب ، قم بزرع الخلايا في حامل العينة.

أضف 0.2 ميكرولتر من محلول كرة البوليسترين بحجم 10٪ إلى العينة. ضع غطاء الغطاء الثاني فوق الحلقة المطاطية. أغلق الإعداد وأكمل تحضير العينة.

أخيرا ، انقل العينة بأكملها إلى المجهر. لبدء التجربة ، استخدم نظام OT ، وحبس الكرة باستخدام ليزر OT ، ثم قم بإرفاقها بغطاء الغطاء ، بالقرب من الخلية. بعد ذلك ، قم بملائمة كرة أخرى وكرر نفس إجراء التعلق بالضغط على الكرة مقابل سطح الخلية ، بالقرب من السطح العلوي وبالقرب من حافة الخلية.

أضف دالة جيبية للسعة والترددات المتفاوتة. بعد ذلك ، اضغط على زر البدء ، باستخدام المرحلة الكهرضغطية للسماح بالإزاحة الكهرضغطية. احتفظ بكرة كرات الدم الحمراء في المصيدة وأرسل العينة إلى دورة من الحركات باستخدام الوظيفة الجيبية المحددة مسبقا.

للتحليل ، افتح برنامج ImageJ واستورد الفيلم بأكمله الذي تم الحصول عليه أثناء الحركات الجيبية. انقر فوق ضبط ، ثم حدد عتبة الخيار. اضبط العتبة باستخدام كل من أشرطة التمرير ، وحدد المجال المرجعي بالنقر فوق ملف ، متبوعا بالمستطيل.

ثم في علامة التبويب تحليل ، انقر فوق تعيين القياسات "وحدد مركز الكتلة"الخيار. انقر مرة أخرى على علامة التبويب تحليل وحدد تحليل الجسيمات. ستظهر نافذة جديدة تحتوي على جدول به إحداثيات xy لمركز الكتلة.

كرر الإجراء الخاص بالكرة الأخرى المتصلة بسطح كرات الدم الحمراء. افتح برنامج التحليل واستورد ملفات txt التي تم الحصول عليها مسبقا. قم بإنشاء مخطط مع مراكز الكتلة على المحور ص والوقت على المحور السيني.

ارسم النتائج على رسم بياني باستخدام المحور x لثابت الخسارة ، المشار إليه ب K عدد أولي مزدوج ، والمحور y لثابت التخزين ، المشار إليه ب K عدد أولي. أولا ، للحصول على الفيديو ، حرك المرحلة الكهرضغطية في الاتجاه xy ، باستخدام البرنامج للبحث عن خلية معزولة متصلة بغطاء الغطاء. فخ وأرفق كرة من البوليسترين ذات قطر معروف بسطح كرات الدم الحمراء.

بعد ذلك ، باستخدام المرحلة الكهرضغطية ، حرك الخرزة المحاصرة المتصلة بسطح كرات الدم الحمراء لتشويه الخلية ، ثم قم بتوصيل الخرزة بالشفة الغطاء. الآن ، قم بتغيير موضع المحور z للعثور على الصورة المركزة. بعد تحديد الموضع ، استخدم برنامج الكاميرا لإنشاء فيلم للخلية بأكملها.

بعد ذلك ، حرك موضع المحور z بمقدار ميكرومترين لأسفل أو لأعلى للحصول على صورة غير مركزة للخلية المختارة. أخيرا ، دون تغيير موضع المحور z ، ابحث عن منطقة بدون خلايا لتكرار نفس الإجراء ، وقم بإنشاء فيلم لخلفية الصورة. للحصول على صورة التباين ، ابحث أولا عن قيمة N صفر ، وانقر على أيقونة اختيار المضلع ، ثم انقر فوق علامة التبويب تحليل وحدد القياس.

بعد ذلك ، استخدم معادلة التباين لتحديد صورة N ناقص N صفر ، وقم بتنفيذ ذلك عن طريق تحديد الرياضيات "قيد العملية ، متبوعة بالطرح. في وقت لاحق ، قسم النتيجة على N صفر ناقص B.أخيرا ، ابحث عن التباين للصور المركزة وغير المركزة. الآن ، استخدم تحويل هارتلي للحصول على سمك كرات الدم الحمراء.

في ImageJ ، انقر فوق العملية ، متبوعا بخيارات FFT"و FFT ، ثم اختر FHT. ثم قم بإجراء التحويل العكسي FHT عن طريق تحديد العملية ، متبوعة ب FFT "و FFT. استخدم الصورة الناتجة للحصول على ملف تعريف الارتفاع.

بعد العثور على الصورة التي تحتوي على ملف تعريف ارتفاع RBC ، استخدم التباين غير البؤري للميكرومتر لإنشاء مجموعة من صورتين في ImageJ. للعثور على عامل الشكل، استخدم ماكرو مخصص ل ImageJ لتحليل المكدس. سيقدم الماكرو جدولا بموضع الحافة والمحيط ومعكوس المحيط وصورة للخلية التي تم تحليلها.

تحقق مما إذا كانت حواف هذه الصورة مشابهة لحواف الشكل المرجعي. خلاف ذلك ، كرر الإجراء ، واستخدم مجموع معكوس المحيط للعثور على عامل الشكل. ابدأ بتنظيم البيانات التجريبية في جدول.

قم بإنشاء جدول جديد في برنامج التحليل بالنقر فوق علامة التبويب ملف. حدد 10 أعمدة مختلفة للمعلمات. لرسم المنحنى G Prime و G الرئيسي المزدوج في برنامج التحليل ، استخدم البيانات من الجدول السابق وانقر على زر "المؤامرة".

للحصول على معلمات Gamma و GM ، انقر فوق علامة التبويب Curve fit وحدد fit1 "لفتح نافذة جديدة. حدد المربع ، وانقر فوق الزر تعريف ، واكتب المعادلة. انقر فوق الزر "موافق" في كلتا النافذتين ، وسيظهر التركيب.

بعد ذلك ، قم بإنشاء مخططين آخرين ، وهما G prime و G double prime كدالة لأوميغا. ضع أشرطة الخطأ فقط على المحور ص ، كما هو موضح سابقا. كرر إجراء تركيب المنحنى ، حدد خيار G".

انقر فوق تعريف المنحنى "ضمن الملاءمة العامة ، ثم اكتب المعادلة المعنية. أخيرا ، انقر فوق "موافق" ، وسيظهر تركيب منحنى مع قيم Alpha و G zero. مرة أخرى ، قم بإجراء تركيب منحنى آخر.

حدد الخيار G ، وانقر فوق تعريف المنحنى "ضمن الملاءمة العامة ، ثم اكتب المعادلة المعنية. أخيرا ، انقر فوق "موافق" ، وسيظهر تركيب منحنى. يوضح الشكل ثابت مرونة التخزين كدالة لثابت مرونة الفقد.

يوضح الاعتماد الخطي الملاحظ أن سطح كرات الدم الحمراء يمكن اعتباره مادة زجاجية ناعمة. من خلال تطبيق قيم عامل الشكل الكلي للخلية وسمك سطح كرات الدم الحمراء ، يمكن تحديد قيم الأس ألفا. قد توفر هذه التقنية الأساس لطرق تشخيصية جديدة تربط التغيرات في خصائص اللزوجة المرنة لكرات الدم الحمراء بتعديلات في تدفق الدم للأفراد الذين يعانون من أمراض مختلفة.