بناء طفرات متماثلة الزيجوت من الجراد المهاجر باستخدام تقنية كريسبر / كاس 9

الجراد المهاجر هو اختبار زراعي مهم. توفر هذه الطريقة بروتوكولا فعالا وسهل الخضوع لطرق الضغط الجيني ل إنها طريقة منهجية ومفصلة لبناء CRISPR / CAS9 لمتحولات الجراد متماثل الزيجوت ، بما في ذلك جمع البويضات وفحص الطفرات والحفاظ على الزيجوت المتماثل. للبدء ، قم بإعداد إبر الحقن عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب ماصة صغير.

اضبط المعلمات كما هو موضح في المخطوطة النصية ، ثم قم بطحن طرف إبرة الحقن بمطحنة صغيرة. تحضير بروتين الريبونوكليو للحقن عن طريق خلط ميكرولتر واحد من بروتين Cas9 مع ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي الدليل الفردي الذي تم التحقق منه. ثم أضف ثمانية ميكرولترات من الماء المعقم الحر للحمض النووي الريبي لجعل الحجم النهائي للخليط ، 10 ميكرولتر.

امزج المحلول جيدا وضعه على الجليد. بعد ذلك ، اجمع قرون البيض الطازجة من جراب موضع البويضة ، وانتظر دباغة البيض. بعد 30 دقيقة ، استخدم فرشاة ناعمة لعزل البيض عن قرون البيض في الماء ، واغسل البيض ثلاث مرات بالماء المعقم.

ثم ضع البيض في طبق بتري وأضف الماء المعقم للحفاظ على رطوبته. املأ إبرة الحقن بمحلول بروتين الريبونوكليو المحضر ، وقم بتحميل الحقن إلى المعالج الدقيق. اضبط معلمات الحقن المجهري على أنها 300 هيكتوباسكال من ضغط الحقن ، و 0.5 ثانية من وقت الحقن و 25 هيكتوباسكال من ضغط التعويض.

عند ضبط المعلمات ، اضغط على الدواسة لتقييم حجم المحلول المحقون. اضبط ضغط الحقن ووقت الحقن للتأكد من أن حجم الحقن حوالي 50 إلى 100 نانولتر. بعد ترتيب البيض المعقم بانتظام على وسادة الحقن ، ضع الوسادة على طاولة الكائن في المجهر واضبط تكبير المجهر حتى يتم ملاحظة البيض.

ثم اضبط إبرة الحقن المجهري تحت المجهر حتى يمكن رؤية طرف الحقن ووضع الطرف بالقرب من البويضة المراد حقنها. ابدأ الحقن على ارتفاع مناسب وزاوية من 30 إلى 45 درجة. أدخل الطرف في البيضة بالقرب من أكوام البيضة الدقيقة واضغط على الدواسة لإنجاز الحقن.

بعد ذلك ، اسحب الإبرة بسرعة وحرك وسادة الحقن لحقن البويضة التالية. انقل البيض المحقون إلى طبق استزراع بقطعة من ورق الترشيح الرطب. ضعها في حاضنة عند 30 درجة مئوية.

بعد الحقن ، تحقق من تطور البيض المحقون كل يوم. انقل البيض المحقون إلى طبق استزراع جديد كل 24 ساعة في الأيام الخمسة الأولى. في اليوم السادس بعد الحقن ، اختر ونقل 10 بيضات بشكل عشوائي إلى أنبوب وطحن البيض بشكل كاف مع كرتين فولاذيتين عند 60 هرتز لمدة ست دقائق باستخدام مطحنة.

بعد الطحن ، أعد تعليق الحطام في ملليلتر واحد PBS. ثم انقل خمسة ميكرولترات من الخليط المعاد تعليقه إلى 45 ميكرولترا من 50 مليمول هيدروكسيد الصوديوم إلى التحلل عند 95 درجة سلزية لمدة خمس دقائق. لإنهاء تفاعل التحلل القلوي ، أضف خمسة ميكرولترات من محلول تريس هيدروكلوريد المولي الواحد إلى نظام التحلل.

خذ ميكرولترا واحدا من منتج التحلل كقالب PCR لتضخيم جزء الجين المستهدف. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسلسل ، قارن نتائج التسلسل مع تسلسل النوع البري لتقييم ما إذا كان نظام CRISPR / Cas9 قد شق الجين المستهدف في الجسم الحي. السماح لبقية البيض للتطور اللاحق كما يتم الكشف عن indels في المرحلة الجنينية.

بعد التطوير ، نقل وتربية الحوريات المفرغة إلى قفص تربية كما هو موضح في المخطوطة. عندما تتطور الحوريات إلى المرحلة الخامسة ، افصلها بأكواب الثقافة البلاستيكية. إجراء التهجين باستخدام طفرات G0 والجراد البري.

بعد جمع oassists ، استخدم ثلاث إلى ست بويضات مطورة في كل oassist للكشف عن الطفرات كما هو موضح سابقا. حافظ على oassists إيجابية الطفرة للتطور اللاحق والتخلي عن oassists الطفرة. للحفاظ على التبريد ، اغسل البيض بالماء المعقم واحتضانه في طبق استزراع كما هو موضح من قبل.

بعد خمسة إلى ستة أيام ، اجمع البيض معا في طبق الاستزراع ، وقم بتغطيته بشظايا ورق الترشيح. ثم لف طبق الثقافة بأكمله بفيلم البارافين. ضع الطبق على حرارة 25 درجة مئوية لمدة يومين ، يليه يومان آخران عند درجة حرارة منخفضة من 13 إلى 16 درجة مئوية.

ثم انقل الطبق إلى ثلاجة ست درجات مئوية. أضف الماء إلى الطبق كل أسبوعين لتوفير بيئة رطبة للبيض. أخيرا ، لإنعاش البيض المحفوظ بالتبريد ، ضع طبق بتري على حرارة 25 درجة مئوية لمدة يومين.

في وقت لاحق ، ضع البيض في حاضنة 30 درجة مئوية حتى تفقس الحوريات. في هذه الدراسة ، كان الموقع المستهدف لنظام CRISPR / Cas9 موجودا في أول إكسون. في مقايسة الانقسام Cas9 ، يمكن لبروتين CRISPR / Cas9 ribonucleo هضم جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على الموقع المستهدف بمعدل انشقاق يبلغ حوالي 55٪ ، وقد اقترحت نتائج التسلسل لتقدير معدل طفرة المرحلة الجنينية تحريرا فعالا للجينوم في الموقع المستهدف.

أدت كفاءة التحرير إلى معدل فقس حورية بنسبة 52.73٪ و 66.67٪ من البالغين G0 كانوا طفرات فسيفساء. تظهر استراتيجية المرور للخطوط المتحولة هنا. تم حفظ البيض متماثل الزيجوت الزائد بالتبريد لتحسين معدل استخدام الزيجوت المتماثل.

على الرغم من انخفاض معدل فقس البيض المحفوظ بالتبريد مع تمديد وقت الحفظ بالتبريد ، إلا أن الإجراءات العلاجية مثل تطبيق شظايا ورق الترشيح واستعادة هذه البيض المحفوظ مع تدرج ارتفاع درجة الحرارة كانت مفيدة للإنعاش. الشيء الأكثر أهمية هو محاولة الحد من الأضرار الميكانيكية الناجمة عن الحقن المجهري. يمكن استخدام هذا الإجراء كمرجع لتحقيق الحشرات الأخرى.

يجب تعديل جزء من بعض التفاصيل مثل طرق جمع البيض والحقن والمحصول. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة أيضا لدراسة التحول والتكيف البيئي للحشرات وبناء طفرات الجراد متماثل الزيجوت التي سرعت البحث في هذا المجال.