Name: تطبيق تداخل الحمض النووي الريبي في نيماتودا خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: تعلم تطبيق تداخل الحمض النووي الريبي في نيماتودا خشب الصنوبر Bursaphelenchus xylophilus باستخدام طريقة النقع في dsRNA. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة وظائف الجينات والتحكم البيولوجي في النيماتودا المسببة للأمراض.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31870637 ، 31200487) وبتمويل مشترك من خطة تشجيانغ الرئيسية للبحوث (2019C02024 ، LGN22C160004).

تمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس التجارب على الحيوانات بجامعة تشجيانغ الزراعية والحرجية. تم استخراج B. xylophilus المعزول NXY61 في الأصل من صنوبر ماسونيانا مريض في منطقة نينغبو بمقاطعة تشجيانغ ، الصين11.
1. استنساخ الجينات
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الاشعال المستخدمة في هذا البروتوكول.
<ol><li>جمع الديدان الخيطية.<ol><li>ثقافة B. xylophilus سلالة على mycelia من Botrytis cinerea على لوحات البطاطا سكر العنب أجار (PDA) في 25 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام.</li>
		<li>جمع الديدان الخيطية باستخدام طريقة قمع بيلمان14.<ol><li>ضع أنبوبا مطاطيا مثبتا أسفل القمع وضع طبقتين من ورق الترشيح في فم القمع. انقل الثقافات الفطرية إلى القمع وأضف الماء لغمر الحصيرة الفطرية. انتظر لمدة 2 ساعة ، ثم اجمع الديدان الخيطية.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الديدان الخيطية باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي الكلي (انظر جدول المواد)11 وفقا للخطوات التالية.<ol><li>أضف 500 ميكرولتر من كاشف الاستخراج و 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب طرد مركزي 2 مل. استنشاق 20 ميكرولتر من الديدان الخيطية ونقل العينة إلى مطحنة لطحنها عند 9000 × غرام لمدة 30 ثانية. احتضان لمدة 5 دقائق ثم جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 12000 × غرام و 4 درجات مئوية.</li>
		<li>نقل supernatant إلى أنبوب جهاز طرد مركزي جديد. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم ، وقم بتغطية الأنبوب ، واخلطه عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. احتضنها لمدة 3 دقائق ثم جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 12000 × غرام عند 4 درجات مئوية.</li>
		<li>نقل supernatant إلى أنبوب جهاز طرد مركزي جديد. أضف 250 ميكرولتر من كحول الأيزوبروبيل والدوامة بقوة. جهاز طرد مركزي بسرعة 12000 × غرام لمدة 10 دقائق.</li>
		<li>تخلص من السوبرناتانت. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪ لغسل الحمض النووي الريبي ثم دوامة العينة. قم بطرده المركزي لمدة 5 دقائق عند 12000 × جم و 4 درجات مئوية.</li>
		<li>جفف حبيبة الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>أعد تعليق الكريات في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.</li>
		<li>احسب تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام الصيغة: تخفيف × A260 × 40 = ميكروغرام RNA/mL. احسب نسبة A260/A280. ملاحظة: تعتبر نسبة ~ 2 نقية.</li>
	</ol></li>
	<li>إجراء النسخ العكسي للحمض النووي الريبي ذات النوعية الجيدة للحصول على قالب cDNA.<ol><li>تصميم واستخدام زوج من الاشعال المحددة، ppm-1-F/R (انظر جدول المواد)، لتضخيم تسلسل الترميز الجزئي للجين Bx-ppm-1 في B. xylophilus (رقم انضمام بنك الجينات QTZ96795). </li>
		<li>استنساخ تسلسل الجينات ppm-1 في ناقل pGEM-Teasy الذي يحتوي على مروج T7 باتباع بروتوكول استنساخ قياسي11.<ol><li>قم بإعداد تفاعلات PCR على النحو التالي: 2 ميكرولتر من cDNA ، و 25 ميكرولتر من 2x Ex Taq Polymerase Premix ، و 2 ميكرولتر من كل تمهيدي (10 pmol / l) ، والماء المقطر المعقم إلى حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر.</li>
			<li>قم بإجراء التضخيم على النحو التالي: 5 دقائق عند 94 درجة مئوية ؛ تليها 35 دورة من 30 ثانية عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 55 درجة مئوية ، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ؛ وخطوة تمديد نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.</li>
			<li>استنساخ المنتجات المضخمة إلى متجه pGEM-T Easy للتسلسل.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. توليف dsRNA
<ol><li>قم بإعداد قالب الحمض النووي لتخليق dsRNA باستخدام PCR مع الاشعال المصممة لإضافة مواقع الترويج T7 في كلا الطرفين. أضف تسلسل المروج T7 إلى نهاية 5 أقدام من التمهيدي.</li>
	<li>استخدم البلازميد الذي يحتوي على جزء الجين ppm-1 (894 bp) كقالب ل PCR واسترجع الجزء الذي يحتوي على مروج T711. استخدم إجراء PCR والنظام الموضح أعلاه.</li>
	<li>استخدم مجموعة نسخ في المختبر لتوليف dsRNA11.<ol><li>إذابة الكواشف المجمدة على الجليد.</li>
		<li>أضف 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل 10x ، و 2 ميكرولتر من مزيج الإنزيم ، و 1 ميكروغرام من الحمض النووي إلى أنبوب طرد مركزي. أضف ماء خاليا من النوكليز لإنتاج تفاعل قياسي 4 ميكرولتر. ثم ، امزج كميات متساوية من محاليل الريبونوكليوتيد الأربعة (ATP ، CTP ، GTP ، و UTP) معا وأضف 8 ميكرولتر من الخليط إلى الأنبوب. تخلط جيدا وتحضن في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.</li>
		<li>أضف 1 ميكرولتر من DNase ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
		<li>أوقف التفاعل وأضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز و 30 ميكرولتر من محلول ترسيب LiCl لترسيب الحمض النووي الريبي. اخلطي جيدا. احتضان في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
		<li>جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 12000 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.</li>
		<li>أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ لغسل الحمض النووي الريبي. دوامة العينة وطردها مركزيا لمدة 10 دقائق عند 12000 × جم و 4 درجات مئوية.</li>
		<li>جفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة 3 دقائق.</li>
		<li>أعد تعليق الكريات في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.</li>
		<li>تحليل جودة الحمض النووي الريبوزي المرسال باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ماصة 1 ميكرولتر من عينة dsRNA على قاعدة القياس وتعيين الطول الموجي إلى 340 نانومتر. تصور المنتجات على هلام الأغاروز بنسبة 1.0٪.</li>
	</ol></li>
</ol>3. الحمض النووي الريبي عن طريق النقع
<ol><li>امزج 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنقع 5x (0.05٪ جيلاتين ، 5.5 mM KH 2 PO 4 ، 2.1 mM NaCl ، 4.7 mM NH4 Cl ، 3 mMspermidine) مع dsRNA و ddH2O لإنتاج حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتروتركيز RNA نهائي قدره 0.8 ميكروغرام / مل.</li>
	<li>الحصول على يرقات J2.<ol><li>جمع الديدان الخيطية من الثقافات الفطرية ونقلها إلى طبق بتري زجاجي قطره 6 سم. أضف 10 مل من الماء إلى الطبق للتأكد من أن الديدان الخيطية يمكنها السباحة بحرية. احتفظ بالديدان الخيطية في الطبق لمدة 30 دقيقة وانتظر حتى يلتصق البيض بالقاع.</li>
		<li>قم بإزالة الماء والديدان الخيطية بعناية ، مع التأكد من عدم إزعاج البيض. كرر الخطوات حتى تتم إزالة جميع اليرقات والبالغين ، مع ترك البيض فقط في الطبق.</li>
		<li>فقس البيض الذي تم جمعه لمدة 24 ساعة في الظلام عند 25 درجة مئوية للحصول على يرقات J2. اجمع يرقات J2 ، وضعها في أنبوب ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام ddH2O لتجربة RNAi15.</li>
		<li>انقل يرقات J2 إلى أنبوب 2 مل الذي يحتوي على محلول dsRNA وأضف محلول ريسورسينول (ملفوف في صفيح ومذاب في الماء) لإنتاج تركيز نهائي بنسبة 1.0٪. احتضن اليرقات بالطرد المركزي عند 15 × جم على طاولة اهتزاز لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية لضمان امتصاص اليرقات بفعالية ل dsRNA.</li>
		<li>نقع نفس الكمية من الديدان الخيطية في المخزن المؤقت للنقع بدون مسبار dsRNA أو باستخدام مسبار GFP dsRNA كعنصر تحكم. استخدم جين GFP (gfp ، M62653.1) كعنصر تحكم غير داخلي المنشأ وتوليف dsRNA من gfp باستخدام الاشعال الخاصة بالجينات T7-GFP-F / R.</li>
	</ol></li>
</ol>4. الكشف عن qPCR
<ol><li>نظف يرقات J2 باستخدام ddH2O ، بما في ذلك تلك التي تعاني من تداخل جيني مستهدف ، وتداخل جيني GFP ، ومجموعة التحكم غير المضطربة. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من كل مجموعة باستخدام الطريقة الموضحة أعلاه.</li>
	<li>بدء تشغيل qPCR.<ol><li>صمم التمهيدي q-ppm-1-F/R باستخدام البرنامج المطلوب (انظر جدول المواد).</li>
		<li>قم بإعداد تفاعل qPCR في 12 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكرولتر من cDNA ، و 6 ميكرولتر من بريمكس الفلورسنت ، و 0.4 ميكرولتر من كل تمهيدي (10 pmol / l) ، وماء مقطر معقم.</li>
		<li>أداء qPCR على النحو التالي: 2 دقيقة عند 95 درجة مئوية ؛ تليها 40 دورة من 10 ثانية عند 95 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 55 درجة مئوية ، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية.</li>
		<li>استخدم جين actb (رقم انضمام بنك الجينات EU100952) وجين tbb-2 (رقم انضمام بنك الجينات MT769316) ، أو جينات أخرى ، كجينات مرجعية داخلية لتقييم التغيرات في مستوى التعبير الجيني بعد RNAi15.</li>
	</ol></li>
	<li>وفقا لقيمة عتبة الدورة (Ct) ومنحنى الانحلال ، استخدم طريقة 2-ΔΔCt لتقدير مستوى التعبير النسبي للجين المستهدف والتحقق من كفاءة التداخل.<ol><li>اطرح قيمة Ct للجين المرجعي الداخلي لكل عينة من قيمة Ct للجين المستهدف للحصول على قيمة ΔCt. ثم، اطرح قيمة ΔCt لمجموعة التداخل من قيمة ΔCt للمجموعة الضابطة للحصول على قيمة ΔΔCt. ملاحظة: تشير قيمة ΔΔCt الأكبر من 0 إلى أن التداخل فعال.</li>
	</ol></li>
</ol>5. تقييم طول الجسم من البالغين الديدان الخيطية بعد الحمض النووي الريبي
<ol><li>بعد RNAi ، استزرع يرقات J2 حتى سن البلوغ على مروج B. cinerea في ألواح PDA لمدة 60 ساعة عند 25 درجة مئوية15.</li>
	<li>اجمع البالغين باستخدام طريقة قمع Bellman (راجع الخطوة 1.1.2.1)14.</li>
	<li>احصل على صور للديدان الخيطية البالغة تحت المجهر واستخدم برنامج ImageJ (أو برامج قياس أخرى) لقياس أطوال الجسم.<ol><li>قم بقياس الطول باستخدام ImageJ عن طريق تحديد تحليل | تعيين المقياس. إذا كانت المسافة معروفة، فأدخل قيمة طول الخط المستقيم المرسوم. أدخل وحدة الطول.</li>
		<li>حدد خانة الاختيار عمومي (استخدم هذا المعيار لكافة الصور)، وانقر فوق موافق لتحديد الطول المراد قياسه بخط مستقيم على الصورة المراد قياسها.</li>
		<li>استخدم الأمر Ctrl + M (القياس) لعرض النتائج وتسجيلها في نافذة النتائج .</li>
	</ol></li>
	<li>خذ قياسات 50 من الذكور و 50 من الإناث من الديدان الخيطية للتحليل الإحصائي12.</li>
	<li>تحليل البيانات عن طريق حساب المتوسط والانحراف المعياري لكل عينة. قارن بين وسائل العينات من المجموعات المختلفة باستخدام اختبار t للطالب.</li>
</ol>

<ol><li>Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicol%2C+JM+%22Genomics+and+Molecular+Genetics+of+Plant-Nematode+Interactions%22">Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions</a>. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).</li>
<li>Jones, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant-parasitic+nematodes+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+insights+into+the+origin+of+parasitism+in+the+emerging+plant+pathogen+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219(2011).</li>
<li>Megen, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogenetic+tree+of+nematodes+based+on+about+1200+full-length+small+subunit+ribosomal+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences.</a> Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).</li>
<li>Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+technology+extends+its+reach%3A+Engineering+plant+resistance+against+harmful+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes.</a> African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).</li>
<li>Marmonier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+acquisition+of+specific+small+interfering+RNAs+inhibits+the+expression+of+some+target+genes+in+the+plant+ectoparasite+Xiphinema+index%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266(2019).</li>
<li>Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attempt+to+silence+genes+of+the+RNAi+pathways+of+the+root-knot+nematode%2C+Meloidogyne+incognita+results+in+diverse+responses+including+increase+and+no+change+in+expression+of+some+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 328(2020).</li>
<li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+akt-1+in+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Forest+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Forest Pathology. 51 (1), 12647(2021).</li>
<li>Zhou, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mab-3+in+spermatogenesis+and+ontogenesis+of+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bxy-fuca+encoding+%CE%B1-L-fucosidase+plays+crucial+roles+in+development+and+reproduction+of+the+pathogenic+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).</li>
<li>Wang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+daf-8+in+the+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forestry+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Forestry Research. , (2021).</li>
<li>Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+methodology+of+nematode+extraction+from+field+samples%3A+Baermann+funnel+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nematology%22%5BJournal%5D)">On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications.</a> Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).</li>
<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+mating+behavior+in+the+pinewood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842(2016).</li>
<li>Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+reliable+reference+genes+for+RT-qPCR+analysis+of+Bursaphelenchus+mucronatus+gene+expression+from+different+habitats+and+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages.</a> Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-mediated+interference+of+dumpy+genes+in+Bursaphelenchus+xylophilus+by+feeding+on+filamentous+fungal+transformants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants.</a> International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).</li>
<li>Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+cellulose+gene+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%2C+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%3A+GMR%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference.</a> Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).</li>
<li>Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cellulase+gene+knock+down+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+reproduction+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).</li>
<li>Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L-like+cysteine+proteinase+genes+are+associated+with+the+development+and+pathogenicity+of+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215(2019).</li>
<li>Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+C.+elegans%3A+Soaking+in+the+genome+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence.</a> Science. 282 (5388), 430-431 (1998).</li>
<li>Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+double-stranded+RNA+by+pre+parasitic+juvenile+cyst+nematodes+leads+to+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).</li>
<li>Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+of+dual+oxidase+in+the+plant+nematode+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).</li>
<li>Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RNA+interference+to+root-knot+nematode+genes+encoding+esophageal+gland+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).</li>
<li>Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+pathogenicity+proteins+of+the+potato+cyst+nematode+Globodera+rostochiensis+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%3A+MPMI%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).</li>
<li>Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+clone+and+its+RNAi+interference+effect+analysis+of+mapk+gene+in+Bursaphelenchus+xylophilus+%28+in+Chinese%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Phytopathologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese).</a> Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).</li>
<li>Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Bxpel1+gene+silencing+by+dsRNA+interference+on+the+development+and+pathogenicity+of+the+pine+wood+nematode%2C+Bursaphelenchus+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125(2016).</li>
<li>Dulovic, A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+knockdown+of+daf-12+in+the+model+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705(2019).</li>
<li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+gene+editing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li>
<li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li>
<li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+insect-resistant+plants%3A+RNAi-mediated+crop+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li>
</ol>

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

على الرغم من أن تاريخ الحياة والبيئة الطفيلية ل B. xylophilus تختلف عن تلك الموجودة في الديدان الخيطية الأخرى ، إلا أنه كان هناك بحث محدود حول التسبب الجزيئي لهذا العامل الممرض النباتي. على الرغم من التقدم الكبير المحرز في تطبيق تقنية تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 في C. elegans والديدان الخيطية الأخرى ، إلا أن تقنية RNAi المطبقة على B. xylophilus هي الوحيدة التي تم نشرها حتى الآن17. RNAi هي واحدة من أقوى الأدوات المتاحة لدراسة الوظيفة الجينية للديدان الخيطية وقد استخدمت عل...

<a href="https://app.jove.com/t/6669">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/63645-v">10.3791/63645-v</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63645">Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus</a>. The Abstract and Protocol section was updated.

Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

تشكل الديدان الخيطية الطفيلية النباتية (PPNs) تهديدا مستمرا للأمن الغذائي والنظم الإيكولوجية للغابات. فهي تسبب خسائر اقتصادية تقدر بنحو 100 مليار دولار أمريكي كل عام1 ، وأكثرها إشكالية هي في المقام الأول الديدان الخيطية ذات العقدة الجذرية ، والديدان الخيطية الكيسية ، والديدان الخيطية من خشب الصنوبر. الديدان الخيطية من خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus ، هي نيماتودا مهاجرة ، طفيليات داخلية ، وهي الممرض السببي لمرض ذبول الصنوبر2. وقد تسبب في ضرر كبير لغابات الصنوبر في جميع أنحاء العالم3. باستخدام مصطلحات Van Megen et al.4 ، B. xylophilus هو عضو في Parasitaphelenchidae وينتمي إلى clade 10 ، في حين أن معظم الطفيليات النباتية الرئيسية الأخرى تنتمي إلى clade 12.
كطفيلي نباتي مستقل ومتطور مؤخرا ، يعد B. xylophilus نموذجا جذابا للدراسات المقارنة. وحتى الآن، أجريت بحوث كبيرة على الديدان الخيطية ذات عقدة الجذر والديدان الخيطية الكيسية التي تنتمي إلى الفصيلة 12، وهي طفيليات داخلية ملزمة ومستقرة وهي من أكثر الديدان الخيطية التي تمت دراستها بشكل مكثف. ومع ذلك ، فإن إجراء المزيد من الأبحاث في هذا المجال المهم يأتي مع تحد كبير: وظيفة جينات التطفل هي عنق الزجاجة البحثي. تشمل الدراسات الوظيفية عموما التعبير خارج الرحم وتجارب الضربة القاضية / الخروج ولكنها تعتمد على بروتوكولات التحول الجيني الفعالة للديدان الخيطية. ونتيجة لذلك ، يعتمد علم الوراثة العكسي في PPNs بشكل حصري تقريبا على إسكات الجينات بواسطة RNAi.
RNAi ، وهي آلية موجودة على نطاق واسع في الخلايا حقيقية النواة ، تسكت التعبير الجيني عن طريق إدخال الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA)5. حتى الآن ، تم العثور على آلية إسكات الجينات بعد النسخ التي يسببها dsRNA في جميع حقيقيات النوى المدروسة ، وتطورت تقنية RNAi ، كأداة لأبحاث الجينوم الوظيفي والتطبيقات الأخرى ، بسرعة في العديد من الكائنات الحية. منذ اكتشاف آلية RNAi في Caenorhabditis elegans في عام 19986 ، أصبحت تقنيات RNAi طرقا فعالة لتحديد الوظيفة الجينية للديدان الخيطية ويتم اقتراحها كطريقة جديدة للسيطرة الفعالة على الديدان الخيطية المسببة للأمراض7.
RNAi هو من الناحية الفنية سهلة نقع الأحداث في dsRNA يمكن أن يكفي. ومع ذلك ، فإن فعالية هذا النهج وقابليته للتكرار تختلف اختلافا كبيرا مع أنواع الديدان الخيطية والجين المستهدف8. تم التحقيق في إسكات 20 جينا مشاركا في مسارات الحمض النووي الريبي للديدان الخيطية ذات عقدة الجذر ، Meloidogyne incognita ، باستخدام dsRNAs الطويلة كمحفزات ، مما أدى إلى استجابات متنوعة ، بما في ذلك زيادة وعدم حدوث تغيير في التعبير عن بعض الجينات9. تظهر هذه النتائج أن الجينات المستهدفة قد تستجيب لضربة RNAi القاضية بشكل مختلف ، مما يتطلب تقييما شاملا لمدى ملاءمتها كأهداف للتحكم في الديدان الخيطية عبر RNAi. ومع ذلك ، هناك حاليا ندرة في البحوث حول البيولوجيا التنموية والإنجابية ل B. xylophilus.
استمرارا للعمل السابق10،11،12،13 ، نصف هنا بروتوكولا لتطبيق RNAi لدراسة وظيفة جين ppm-1 من B. xylophilus ، بما في ذلك تخليق dsRNA ، ونقع المنشطات العصبية الاصطناعية ، والكشف الكمي عن تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR). من المرجح أن تساهم المعرفة المكتسبة من هذا النهج التجريبي بشكل ملحوظ في فهم النظم البيولوجية الأساسية ومنع مرض ذبول الصنوبر.

<table><tbody><tr><td>قمع بيرمان</td><td>لا يوجد</td><td>لا يوجد</td><td>لعزل الديدان الخيطية</td></tr><tr><td>بيكون ديزاينر 7.9</td><td>شركة شنغهاي كانغيوشينغ لتقنية المعلومات</td><td>لا يوجد</td><td>لتصميم بادئات qPCR</td></tr><tr><td>Botrytis cinerea</td><td>لا يوجد</td><td>لا يوجد</td><td>كطعام للديدان الخيطية</td></tr><tr><td>Bursaphelenchus xylophilus</td><td>لا يوجد</td><td>لا يوجد</td><td>كان رقمها NXY61 وقد تم استخراجه أصلا من صنوبر ماسونيانا المريض في نينغبو، مقاطعة تشجيانغ، الصين.</td></tr><tr><td>حاضنة درجة حرارة ثابتة</td><td>شركة أدوات مختبر جينغ هونغ في شنغهاي</td><td>H1703544</td><td>إلى دودة الديدان الخيطية الثقافية</td></tr><tr><td>جهاز الرحلان الكهربائي</td><td>مختبرات بيو-راد</td><td>1704466</td><td>لتحقيق التحليل الكهربائي</td></tr><tr><td>الإيثانول، 75٪</td><td>شركة سينوفارم للمواد الكيميائية للكاشف</td><td>80176961</td><td>لاستخراج الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>إكس تاك بوليميراز بريمكس</td><td>شركة تاكارا بيو إنك.</td><td>RR030A</td><td>ل PCR</td></tr><tr><td>إكس تاك بوليميراز بريمكس</td><td>شركة تاكارا بيو إنك.</td><td>RR390A</td><td>ل PCR</td></tr><tr><td>كاميرا الجل</td><td>شركة لونغجين للأدوات العلمية</td><td>LG2020</td><td>لجعل أحزمة الأحماض النووية مرئية</td></tr><tr><td>جراف باد بريزم 8</td><td>منشور جراف باد</td><td>لا يوجد</td><td>تحليل البيانات وصنع الأشكال</td></tr><tr><td>الطرد المركزي عالي السرعة</td><td>شركة هانغتشو ألشينغ للآلات</td><td>AS0813000</td><td>جهاز الطرد المركزي</td></tr><tr><td>مطحنة الأنسجة عالية التدفق</td><td>بيرتين</td><td></td><td>لاستخراج الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>برنامج ImageJ</td><td>المعاهد الوطنية للصحة</td><td>لا يوجد</td><td>لقياس أطوال الجسم</td></tr><tr><td>كحول الأيزوبروبيل</td><td>شركة شنغهاي علاء الدين للتكنولوجيا الكيميائية الحيوية</td><td>L1909022</td><td>لاستخراج الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>مجهر لايكا DM4B</td><td>شركة لايكا مايكروسيستمز</td><td></td><td>لمراقبة الديدان الخيطية</td></tr><tr><td>الخرزات المغناطيسية</td><td>شركة أوران للعلوم والتكنولوجيا</td><td>150010C</td><td>لاستخراج الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>مجموعة النسخ عالية العائد MEGAscript T7</td><td>شركة ثيرمو فيشر العلمية</td><td>AM1333</td><td>لتخليق dsRNA في المختبر</td></tr><tr><td>مطياف نانوسدروب ND-2000</td><td>شركة ثيرمو فيشر العلمية</td><td>نانو دروب 2000/2000C</td><td>لتحليل جودة dsRNA</td></tr><tr><td>مضخم PCR</td><td>شركة منتجات بيو-راد لايف الطبية</td><td>1851148</td><td>لتضخيم تسلسل الأحماض النووية</td></tr><tr><td>أطباق بترى</td><td>لا يوجد</td><td>لا يوجد</td><td>إلى دودة الديدان الخيطية الثقافية</td></tr><tr><td>pGEM-T متجه سهل</td><td>شركة بروميغا</td><td>A1360</td><td>للاستنساخ</td></tr><tr><td>أجار دكستروز البطاطس (متوسط)</td><td>لا يوجد</td><td>لا يوجد</td><td>إلى ثقافة Botrytis cinerea</td></tr><tr><td>مجموعة كاشف RT من برايم سكريبت مع ممحاة gDNA</td><td>شركة تاكارا بيو إنك.</td><td>RR047B</td><td>إلى cDNA الصناعي</td></tr><tr><td>برايمر بريميير 5.0</td><td>بريميير بايوسوت</td><td>لا يوجد</td><td>لتصميم بادئات PCR</td></tr><tr><td>البادئات: ppm-1-F/R</td><td>شركة تسينغكه للتكنولوجيا الحيوية</td><td>لا يوجد</td><td>مهاجم: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td></tr><tr><td>q-ppm-1-F/R</td><td>شركة تسينغكه للتكنولوجيا الحيوية</td><td>لا يوجد</td><td>مهاجم: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>مدار دورة حرارية في الوقت الحقيقي&nbsp; كيوبرج 2.2</td><td>شركة أناليتيك جينا إنسترومنتس (بكين)</td><td></td><td>ل qPCR</td></tr><tr><td>طاولة تهز</td><td>شركة شنغهاي تشيتشنغ لتصنيع الأدوات التحليلية.</td><td></td><td>لنقع الديدان الخيطية</td></tr><tr><td>المجهر المجسم</td><td>شركة تشونغتشينغ أوبتك للآلات</td><td>1814120</td><td>لمراقبة الديدان الخيطية</td></tr><tr><td>T7-GFP-F/R</td><td>شركة تسينغكه للتكنولوجيا الحيوية</td><td>لا يوجد</td><td>مهاجم: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; مروج T7</td><td>شركة تسينغكه للتكنولوجيا الحيوية</td><td>لا يوجد</td><td>TAATACGACTCACTATAGGG</td></tr><tr><td>مجموعة استخراج الحمض النووي من تاكارا ميني بيست جل أغاروز</td><td>شركة تاكارا بيو إنك.</td><td>9762</td><td>لاستعادة الحمض النووي</td></tr><tr><td>تاكارا TB جرين بريمكس إكس تاك (Tli RNaseH Plus)</td><td>شركة تاكارا بيو إنك.</td><td>RR820A</td><td>ل qPCR</td></tr><tr><td>ثلاثي كلورو إيثان</td><td>شركة شنغهاي لينغ فنغ للمواد الكيميائية للكاشف</td><td></td><td>لاستخراج الحمض النووي الريبي</td></tr><tr><td>واشع تريزول</td><td>شركة ثيرمو فيشر العلمية</td><td>15596026</td><td>كاشف استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي، لاستخلاص الحمض النووي الريبي</td></tr></tbody></table>

تطبيق تداخل الحمض النووي الريبي في نيماتودا خشب الصنوبر ، bursaphelenchus xylophilus

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

الديدان الخيطية من خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus ، هي واحدة من أكثر الأنواع الغازية تدميرا في جميع أنحاء العالم ، مما تسبب في ذبول أشجار الصنوبر وموتها في نهاية المطاف. على الرغم من الاعتراف بأهميتها الاقتصادية والبيئية ، فقد كان من المستحيل حتى الآن دراسة الوظائف الجينية التفصيلية للديدان الخيطية الطفيلية النباتية (PPNs) باستخدام علم الوراثة التقليدي الأمامي والطرق المعدلة وراثيا. ومع ذلك ، كتقنية علم الوراثة العكسية ، يسهل تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) دراسة الجينات الوظيفية للديدان الخيطية ، بما في ذلك B. xylophilus. 
تحدد هذه الورقة بروتوكولا جديدا للحمض النووي الريبي للجين ppm-1 في B. xylophilus ، والذي تم الإبلاغ عنه للعب أدوار حاسمة في تطوير وتكاثر الديدان الخيطية المسببة للأمراض الأخرى. بالنسبة ل RNAi ، تم ربط مروج T7 بطرف 5 ′ للجزء المستهدف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وتم تصنيع الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) عن طريق النسخ في المختبر . في وقت لاحق ، تم إنجاز تسليم dsRNA عن طريق نقع الديدان الخيطية في محلول dsRNA مختلطة مع المنشطات العصبية الاصطناعية. تم غسل الأحداث المتزامنة من B. xylophilus (حوالي 20000 فرد) ونقعها في dsRNA (0.8 ميكروغرام / مل) في المخزن المؤقت للنقع لمدة 24 ساعة في الظلام عند 25 درجة مئوية.
تم وضع نفس الكمية من الديدان الخيطية في مخزن مؤقت للنقع بدون dsRNA كعنصر تحكم. وفي الوقت نفسه ، تم وضع كمية أخرى مماثلة من الديدان الخيطية في مخزن مؤقت للنقع مع جين بروتين الفلورسنت الأخضر (gfp) dsRNA كعنصر تحكم. بعد النقع ، تم تحديد مستوى التعبير عن النصوص المستهدفة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. ثم تم تأكيد آثار الحمض النووي الريبي باستخدام الملاحظة المجهرية للأنماط الظاهرية ومقارنة حجم جسم البالغين بين المجموعات. يمكن أن يساعد البروتوكول الحالي في تطوير الأبحاث لفهم وظائف جينات B. xylophilus وغيرها من الديدان الخيطية الطفيلية بشكل أفضل نحو تطوير استراتيجيات التحكم من خلال الهندسة الوراثية.

تحليل تعبير ppm-1 عن B. xylophilus بعد RNAi كان مستوى التعبير النسبي لجين ppm-1 من B. xylophilus المنقوع مع GFP dsRNA والمنقوع بالجين المستهدف dsRNA 0.92 و 0.52 ، على التوالي (تم تعيين مستوى التعبير الجيني ppm-1 لمجموعة التحكم المعالجة ب ddH2O إلى 1) (الشكل 1). وبالتالي ، فإن dsRNA الخارجي ليس له أي تأثير على تعبير ppm-1 ل B. xylophilus...

هنا ، نقدم طريقة نقع مفصلة لتداخل الحمض النووي الريبي في Bursaphelenchus xylophilus لتسهيل دراسة وظائف الجينات.

تطبيق تداخل الحمض النووي الريبي في نيماتودا خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

أصبح الحمض النووي الريبي طريقة فعالة لتحديد وظيفة الجينات في الديدان الخيطية ويتم اقتراحه كطريقة جديدة للسيطرة الفعالة على الديدان الخيطية المسببة للأمراض. RNAi هو نقع الديدان الخيطية في dsRNA يمكن أن يكفي لهذا الإجراء. للبدء ، اجمع الديدان الخيطية بطريقة قمع Baermann.لهذا ، ضع أنبوبا مطاطيا مثبتا أسفل قمع وضع طبقتين من ورق الترشيح في فم القمع. انقل ثقافات Botrytis cinerea الفطرية إلى القمع وأضف الماء لغمر الحصيرة الفطرية. عندما يتم جمع الديدان الخيطية ، أضف 500 ميكرولتر من كاشف الاستخراج و 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب طرد مركزي بملليلترين.استنشاق 20 ميكرولتر من الديدان الخيطية وطحن العينات في 9،000 × غرام لمدة 30 ثانية. احتضان لمدة خمس دقائق وأجهزة الطرد المركزي في 12،000 × غرام لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي جديد.أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم واخلطها عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. احتضنها لمدة ثلاث دقائق ثم قم بجهاز طرد مركزي عند 12،000 × g لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. مرة أخرى ، انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي جديد.أضف 250 ميكرولتر من كحول الأيزوبروبيل والدوامة بقوة. جهاز طرد مركزي في 12،000 × غرام لمدة 10 دقائق ودوامة. تخلص من السوبر ناتانت وأضف 500 ميكرولتر من 75٪ من الإيثانول لغسل الحمض النووي الريبي.دوامة العينة متبوعة بالطرد المركزي عند 12،000 × غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. جفف حبيبة الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة خمس دقائق وأعد تعليقها في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. احسب تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام هذه الصيغة واحسب نسبة A260 إلى A280.بعد ذلك ، استخدم زوجا من الاشعال لتضخيم تسلسل الترميز الجزئي لجين BX ppm-1 من B.xylophilus. ثم قم باستنساخ تسلسل جين واحد ppm-1 في ناقل pGEM-T Easy يحتوي على مروج T7. استرجع الجزء الجيني الطويل ppm-1 للزوج الأساسي 894 باستخدام البلازميد المستنسخ كقالب ل pcr.ثم استخدم مجموعة نسخ في المختبر لتوليف dsRNA. تحليل جودة dsRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتصور المنتجات على هلام الأغاروز 1٪. أضف أربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت للنقع 5X وقم بتكوين الحجم إلى 20 ميكرولتر بالماء المقطر المزدوج للحصول على تركيز الحمض النووي الريبي النهائي البالغ 0.8 ميكروغرام لكل ملليلتر.ثم ضع الديدان الخيطية في الطبق لمدة 30 دقيقة وانتظر حتى يلتصق البيض بالقاع. قم بإزالة الماء والديدان الخيطية بعناية دون إزعاج البيض حتى يبقى البيض فقط في الطبق. فقس البيض الذي تم جمعه في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للحصول على يرقات J2.جمع اليرقات في أنبوب وغسلها ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج. ثم ، انقل اليرقات إلى الأنبوب الذي يحتوي على محلول dsRNA. لهذا ، أضف محلول ريسورسينول للحصول على محلول 1٪.ضع اليرقات على طاولة اهتزاز لضمان امتصاص كاف ل dsRNA في اليرقات. للحصول على عناصر التحكم ، انقع نفس الكمية من الديدان الخيطية في المخزن المؤقت للنقع بدون مسبار dsRNA أو باستخدام مسبار GFP dsRNA. قم بإجراء qPCR باستخدام جينات actB و tbb-2 كمراجع داخلية لتقييم التغيرات في مستوى التعبير الجيني.استخدم طريقة دلتا دلتا سي تي لتقدير مستوى التعبير الجيني النسبي من منحنى الذوبان وقيمة Ct. بعد RNAi ، قم بزراعة يرقات J2 حتى سن البلوغ على مروج Botrytis cinerea على ألواح PDA. اجمع البالغين باستخدام طريقة قمع Baermann كما هو موضح في القسم الأول.احصل على صور للديدان الخيطية البالغة تحت المجهر واستخدم برنامج ImageJ لقياس طول الجسم ل 50 من الذكور و 50 من الإناث من الديدان الخيطية. تحليل البيانات عن طريق حساب المتوسط والانحراف المعياري لكل عينة. تطبيق اختبار t للطالب لمقارنة وسائل العينات من المجموعات المختلفة.أشار تحليل التعبير الجيني النسبي بعد RNAi إلى أن ppm-1 dsRNA يمكن أن يمنع بشكل فعال التعبير عن جين واحد من B.Xylophilus. في حين أن GFP dsRNA الخارجي لم يكن له أي تأثير على تعبير ppm-1. بعد الحمض النووي الريبي ، انخفض حجم البالغين بشكل ملحوظ على الرغم من بلوغهم النضج الجنسي مما أدى إلى النمط الظاهري المتحور الصغير حجم الجسم.كان متوسط طول جسم الإناث والذكور المتحورين 544 و 526 ميكرومتر مقارنة ب 971 و 912 ميكرومتر للمجموعة الضابطة أهم شيء هو نقل الديدان الخيطية إلى محلول الحمض النووي الريبي المزدوج الخيط وإضافة كاشف آخر لتحفيز الديدان الخيطية على التغذية. هذه الطريقة مناسبة لفحص الجينات على نطاق واسع وتستخدم عادة في أبحاث الخلايا. دراسة الوظيفة الجينية ل B.Xylophilus بهذه الطريقة لها قيمة توجيهية للمكافحة البيولوجية ل B.Xylophilus.

application-rna-interference-pinewood-nematode-bursaphelenchus

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن لشرح كيفية استخدام تقنية التغذية رني لاسقاط الجينات المستهدفة والنمط الظاهري نقاط حجم الجسم...

باستخدام الحمض النووي الريبي التي تتوسط استراتيجية التغذية التدخل للكشف عن الجينات المسؤولة عن تنظيم حجم الجسم في نيماتودا<em&gt; C. ايليجانس</em

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) تقنيات الجينات ضربة قاضية المستندة هي في صميم البحث كونفيوسم. هنا، ونحن نقدم لمحة عامة عن أسلوبنا رني اليرقات في كونفيوسم كاستانيم. اليرقات رني هي تقنية بسيطة، ولكنها قوية توفر الوصول السريع إلى الخسارة من وظيفة الظواهر، مما يسمح للباحثين لدراسة وظائف الجينات في سياقات متنوعة.

التدخل RNA اليرقات في الأحمر خنفساء الدقيق، كونفيوسم كاستانيم

RNA Intervention (RNAi) هي أداة قيمة للغاية للكشف عن وظيفة الجينات. ومع ذلك ، فإن القدرة على استهداف الجينات باستخدام الحمض النووي الريبي خلال مراحل ما قبل البلوغ محدودة في ناقل الملاريا البشري الرئيسي Anopheles gambiae. نصف بروتوكول RNAi لتقليل وظيفة الجينات عن طريق الحقن المباشر أثناء تطور العذراء.

رني الزناد تسليم إلى<em&gt; بعوض الملاريا</em&gt; شرانق

يتم تقديم بروتوكول للتحقيق في سلوك التزاوج للديدان الخيطية من خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus. السمات السلوكية ل B. xylophilus موصوفة في عملية التزاوج.

المراقبة والقياس الكمي للسلوك التزاوج في غابة الصنوبر نيماتودا، Bursaphelenchus xylophilus

هنا، نقدم بروتوكولات للتربية وخنفساء المتوسطة الجرثومية، Dermestes المبقعة (د المبقعة) في المختبر. نحن أيضا مشاركة بروتوكولات لرني الجنينية والوالدين وطرق تحليل الظواهر الجنينية لدراسة وظيفة الجينات في هذه الأنواع.

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل، Dermestes المبقعة

يوضح هذا المقال رواية التقنيات المتقدمة للتسليم الشفوي من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) عن طريق الأنسجة الوعائية النباتات لتدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) في ساب لحاء تغذية الحشرات.

طرق التسليم الشفوي الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل للحث على تدخل الجيش الملكي النيبالي في لحاء وتغذية النبات-ساب الحشرات هيميبتيران

تعيش الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية في تكافل مع البكتيريا ومعا تصيب الحشرات بنجاح عن طريق تقويض جهاز المناعة الفطري لديها. لتعزيز البحوث على الأساس الجيني لعدوى الديدان الخيطية ، يتم وصف طرق للحفاظ على الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية ومعالجتها وراثيا.

زراعة الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية والتلاعب بها وراثيا

يمثل التلاعب بتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تحديا هائلا في العديد من الأنواع الطفيلية ذات الحجم الصغير ، مثل دبابير Trichogramma . حددت هذه الدراسة طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. توفر المنهجية الحالية نموذجا قويا للتحقيق في تنظيم الجينات في دبابير Trichogramma .

تدخل الحمض النووي الريبي في طفيلي البيض ، Trichogramma dendrolimi Matsumura

يصف البروتوكول عدوى الديدان الخيطية لخشب الصنوبر في الجسم الحي وفي المختبر لصنوبر الصنوبر وتحليلها المتطاير من خلال كروماتوغرافيا الغاز (GC) و GC إلى جانب قياس الطيف الكتلي (GC-MS).

إصابة الصنوبر في الجسم الحي والمختبري بالديدان الخيطية الخشبية الخزفية Bursaphelenchus xylophilus وعزل المواد المتطايرة المستحثة

يتم تقديم بروتوكول لتوصيل الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA في يرقات دودة القز Bombyx mori للحث على إسكات الجينات من خلال الابتلاع.

تداخل الحمض النووي الريبي اليرقي في دودة القز Bombyx mori من خلال توصيل الجسيمات النانوية للشيتوسان / dsRNA

تعلم تطبيق تداخل الحمض النووي الريبي في نيماتودا خشب الصنوبر Bursaphelenchus xylophilus باستخدام طريقة النقع في dsRNA. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة وظائف الجينات والتحكم البيولوجي في النيماتودا المسببة للأمراض.

تطبيق تداخل الحمض النووي الريبي في نيماتودا خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus

استكشف المزيد من الفيديوهات