تطبيق تداخل الحمض النووي الريبي في نيماتودا خشب الصنوبر ، Bursaphelenchus xylophilus

أصبح الحمض النووي الريبي طريقة فعالة لتحديد وظيفة الجينات في الديدان الخيطية ويتم اقتراحه كطريقة جديدة للسيطرة الفعالة على الديدان الخيطية المسببة للأمراض. RNAi هو نقع الديدان الخيطية في dsRNA يمكن أن يكفي لهذا الإجراء. للبدء ، اجمع الديدان الخيطية بطريقة قمع Baermann.

لهذا ، ضع أنبوبا مطاطيا مثبتا أسفل قمع وضع طبقتين من ورق الترشيح في فم القمع. انقل ثقافات Botrytis cinerea الفطرية إلى القمع وأضف الماء لغمر الحصيرة الفطرية. عندما يتم جمع الديدان الخيطية ، أضف 500 ميكرولتر من كاشف الاستخراج و 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب طرد مركزي بملليلترين.

استنشاق 20 ميكرولتر من الديدان الخيطية وطحن العينات في 9،000 × غرام لمدة 30 ثانية. احتضان لمدة خمس دقائق وأجهزة الطرد المركزي في 12،000 × غرام لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي جديد.

أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم واخلطها عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. احتضنها لمدة ثلاث دقائق ثم قم بجهاز طرد مركزي عند 12،000 × g لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. مرة أخرى ، انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي جديد.

أضف 250 ميكرولتر من كحول الأيزوبروبيل والدوامة بقوة. جهاز طرد مركزي في 12،000 × غرام لمدة 10 دقائق ودوامة. تخلص من السوبر ناتانت وأضف 500 ميكرولتر من 75٪ من الإيثانول لغسل الحمض النووي الريبي.

دوامة العينة متبوعة بالطرد المركزي عند 12،000 × غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. جفف حبيبة الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة خمس دقائق وأعد تعليقها في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. احسب تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام هذه الصيغة واحسب نسبة A260 إلى A280.

بعد ذلك ، استخدم زوجا من الاشعال لتضخيم تسلسل الترميز الجزئي لجين BX ppm-1 من B.xylophilus. ثم قم باستنساخ تسلسل جين واحد ppm-1 في ناقل pGEM-T Easy يحتوي على مروج T7. استرجع الجزء الجيني الطويل ppm-1 للزوج الأساسي 894 باستخدام البلازميد المستنسخ كقالب ل pcr.

ثم استخدم مجموعة نسخ في المختبر لتوليف dsRNA. تحليل جودة dsRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتصور المنتجات على هلام الأغاروز 1٪. أضف أربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت للنقع 5X وقم بتكوين الحجم إلى 20 ميكرولتر بالماء المقطر المزدوج للحصول على تركيز الحمض النووي الريبي النهائي البالغ 0.8 ميكروغرام لكل ملليلتر.

ثم ضع الديدان الخيطية في الطبق لمدة 30 دقيقة وانتظر حتى يلتصق البيض بالقاع. قم بإزالة الماء والديدان الخيطية بعناية دون إزعاج البيض حتى يبقى البيض فقط في الطبق. فقس البيض الذي تم جمعه في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للحصول على يرقات J2.

جمع اليرقات في أنبوب وغسلها ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج. ثم ، انقل اليرقات إلى الأنبوب الذي يحتوي على محلول dsRNA. لهذا ، أضف محلول ريسورسينول للحصول على محلول 1٪.

ضع اليرقات على طاولة اهتزاز لضمان امتصاص كاف ل dsRNA في اليرقات. للحصول على عناصر التحكم ، انقع نفس الكمية من الديدان الخيطية في المخزن المؤقت للنقع بدون مسبار dsRNA أو باستخدام مسبار GFP dsRNA. قم بإجراء qPCR باستخدام جينات actB و tbb-2 كمراجع داخلية لتقييم التغيرات في مستوى التعبير الجيني.

استخدم طريقة دلتا دلتا سي تي لتقدير مستوى التعبير الجيني النسبي من منحنى الذوبان وقيمة Ct. بعد RNAi ، قم بزراعة يرقات J2 حتى سن البلوغ على مروج Botrytis cinerea على ألواح PDA. اجمع البالغين باستخدام طريقة قمع Baermann كما هو موضح في القسم الأول.

احصل على صور للديدان الخيطية البالغة تحت المجهر واستخدم برنامج ImageJ لقياس طول الجسم ل 50 من الذكور و 50 من الإناث من الديدان الخيطية. تحليل البيانات عن طريق حساب المتوسط والانحراف المعياري لكل عينة. تطبيق اختبار t للطالب لمقارنة وسائل العينات من المجموعات المختلفة.

أشار تحليل التعبير الجيني النسبي بعد RNAi إلى أن ppm-1 dsRNA يمكن أن يمنع بشكل فعال التعبير عن جين واحد من B.Xylophilus. في حين أن GFP dsRNA الخارجي لم يكن له أي تأثير على تعبير ppm-1. بعد الحمض النووي الريبي ، انخفض حجم البالغين بشكل ملحوظ على الرغم من بلوغهم النضج الجنسي مما أدى إلى النمط الظاهري المتحور الصغير حجم الجسم.

كان متوسط طول جسم الإناث والذكور المتحورين 544 و 526 ميكرومتر مقارنة ب 971 و 912 ميكرومتر للمجموعة الضابطة أهم شيء هو نقل الديدان الخيطية إلى محلول الحمض النووي الريبي المزدوج الخيط وإضافة كاشف آخر لتحفيز الديدان الخيطية على التغذية. هذه الطريقة مناسبة لفحص الجينات على نطاق واسع وتستخدم عادة في أبحاث الخلايا. دراسة الوظيفة الجينية ل B.Xylophilus بهذه الطريقة لها قيمة توجيهية للمكافحة البيولوجية ل B.Xylophilus.