قياس التفاعلات الملزمة بين Cu(II) وبقايا الببتيد في وجود وغياب الكروموفور

ستسمح هذه الطريقة للباحث بالتحقيق في الأنظمة التي يصعب دراستها ، مثل الببتيدات وأيونات المعادن الانتقالية في الصف الأول ، وكلاهما يمثل تحديا عاما باستخدام تطبيقات أكثر قياسية. الميزة الرئيسية هنا هي استخدام تقنيات متعامدة لأنها تكمل بعضها البعض بشكل جيد ، وهذا يمكن أن يعطي المزيد من التبصر في النظام ويساعدنا على عدم تفويت أي ظاهرة. الطريقة المفصلة في هذا الفيديو مناسبة تماما لدراسة الأنظمة الأخرى.

على الرغم من أننا نعرضه مع Cu (II) والببتيد ، إلا أنه يمكن استخدامه للعديد من تفاعلات الببتيد المعدني والبروتين المعدني المختلفة. أعتقد أن الجزء الأصعب سيكون العثور على خيار عازل جيد لأيون المعدن والببتيد. أود أن أستشير الأدبيات لمعرفة المخازن المؤقتة التي استخدمها الآخرون من قبل.

سيوضح الإجراء سوهي تشوي ، طالب الدراسات العليا في مختبر الأبحاث الخاص بي. للبدء ، قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي الإلكتروني للامتصاص واتركه يسخن لمدة 15 إلى 20 دقيقة تقريبا قبل الاستخدام. ثم قم بتشغيل برنامج مقياس الطيف الضوئي وتكوين المعلمات ، مثل نطاق المسح الضوئي من 200 إلى 900 نانومتر ، ونطاق المسح الضوئي البالغ 200 نانومتر في الثانية ، وتصحيح خط أساس الحزمة المزدوجة.

بعد ذلك ، قم بجمع خط أساس بدون كوفيت أو عينات في مسارات الحزمة. باستخدام اثنين من cuvettes متطابقة في مقياس الطيف الضوئي مزدوج الشعاع ، قم بتحميل cuvette واحد مع 115 ميكرولتر من الماء فائق النقاء والآخر cuvette مع 115 ميكرولتر من عينة الببتيد مع ضمان عدم وجود فقاعات هواء في cuvettes لأنها سوف تتداخل مع الإشارة. بعد ذلك ، ضع الكوفيت بماء فائق النقاء في الشعاع المرجعي والكوفيت مع الببتيد في شعاع العينة.

ثم جمع طيف امتصاص الببتيد الخالي من المعادن. أضف كمية فرعية من محلول Cu(II) إلى الكوفيت مع عينة الببتيد وسجل الحجم لتحليله لاحقا. قم بتوصيل ذلك برفق لأعلى ولأسفل لخلط المحلول مع تجنب توليد فقاعات الهواء.

بعد التوازن لمدة خمس دقائق ، أعد الكوفيت إلى حامل خلية العينة وسجل طيف الامتصاص. ثم كرر إضافة Cu(II)aliquots إلى محلول الببتيد لمختلف المعادلات وسجل الحجم الإجمالي ل Cu(II) المضاف إلى cuvette. بعد تهيئة البرنامج كما هو موضح سابقا في اثنين من cuvettes متطابقة تحميل كوفيت واحد مع 115 ميكرولتر من الماء النقي للغاية وكوفيت أخرى مع 115 ميكرولتر من حل مجمع النحاس الفين.

ضع الكوفيت بالماء في الشعاع المرجعي والكوفيت بمحلول معقد من النحاس وفين في شعاع العينة. ثم جمع طيف امتصاص مجمع ligand المعدني. بعد ذلك ، أضف كمية stoichiometric من الببتيد إلى محلول مجمع النحاس وفين وقم بتوصيله بلطف لأعلى ولأسفل للخلط جيدا مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء.

بعد ذلك ، احتضن المحلول لمدة خمس دقائق للوصول إلى التوازن. ضع الكوفيت مرة أخرى في حامل خلية العينة وسجل طيف الامتصاص. في وقت لاحق ، كرر إضافة أليكوتس الببتيد إلى محلول مجمع النحاس وفين لمختلف المعادلات ، وسجل حجم الببتيد المضاف بحيث يمكن تحديد التركيز المخفف.

قم أولا بتشغيل ITC وقم بتشغيل برنامج ITC لتشغيل الأداة. بعد التهيئة الأولى ، أعد توطين السحاحة واتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة. ثم قم بإزالة السحاحة والغطاء من الخلية المرجعية.

بعد ذلك ، قم بإزالة أي ماء من الخلية المرجعية وشطفه ثلاث مرات باستخدام 450 ميكرولتر من الماء النقي للغاية المنزوع الغاز. اسحب الماء النقي للغاية ببطء إلى علامة 450 ميكرولتر لمحقنة التحميل مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في المحقنة. ثم أدخل حقنة التحميل في الخلية المرجعية حتى تكون على بعد ملليمتر واحد تقريبا من الأسفل وحقن جزء من المحلول ببطء حتى يبقى 150 ميكرولتر في حقنة التحميل.

بعد ذلك ، حرك مكبس حقنة التحميل بسرعة لأعلى ولأسفل بمقدار 25 ميكرولتر تقريبا عدة مرات لإزاحة أي فقاعات على سطح الخلية. ثم حقن ببطء حتى يصل المكبس إلى علامة 100 ميكرولتر على حقنة التحميل ، وبالتالي توزيع ما مجموعه 350 ميكرولتر من الماء النقي للغاية في الخلية المرجعية واستبدال غطاء الخلية المرجعية. بعد إزالة أي محلول متبقي من خلية العينة ، قم بتحميل 450 ميكرولتر من 10 ملليمولار EDTA باستخدام حقنة تحميل وانقع لمدة 10 دقائق لضمان إزالة أيونات المعادن النزرة لأن EDTA سيربط المعادن النزرة.

بعد إزالة محلول EDTA ، اشطف حقنة التحميل جيدا بكميات وفيرة من الماء النقي للغاية. قم بتنظيف ITC وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة عن طريق شطف خلية العينة بالماء النقي للغاية. قم بإزالة أي ماء متبقي من خلية العينة ثم قم بتهيئة خلية العينة عن طريق الشطف ب 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثلاث مرات على الأقل.

بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي الذي يقوم بتكييف خلية العينة وتحميل محلول الببتيد في خلية العينة باستخدام حقنة التحميل. ثم شطف حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي مع 200 ميكرولتر من المحلول المخزن مؤقتا عن طريق إزالة المكبس أولا. باستخدام ماصة صغيرة ، ماصة المحلول العازل من خلال الفتحة الموجودة في الجزء العلوي من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي الزجاجية من خلال المحقنة وإخراج الإبرة أدناه.

في وقت لاحق ، أدخل المكبس بالكامل في حقنة المعايرة. ثم اغمس طرف إبرة حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في المحلول المعدني واسحب المكبس ببطء لأعلى مما يتسبب في ملء المحلول المعدني للمحقنة وينتج عنه حجم فراغ في الجزء العلوي من الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة. لإزالة حجم الفراغ ، قم بتدوير حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي موازية للأرضية.

ثم قم بإزالة المكبس وإمالة الجزء الزجاجي قليلا نحو الأرض. رج حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي بلطف بحيث ينتقل المحلول إلى الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي ويملأ معظم حجم الفراغ. ولكن تأكد من بقاء اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من حجم الفراغ.

مع الحفاظ على المحقنة موازية للأرضية ، أعد إدخال المكبس. ثم امسك حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في وضع مستقيم واغمس طرف الإبرة مرة أخرى في المحلول المعدني. بعد ذلك ، ادفع المكبس لأسفل حتى يتوقف الهواء عن الخروج من الإبرة وقم بتحميل حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي عن طريق سحب المكبس ببطء إلى أعلى بقليل من علامة 50 ميكرولتر مع الحفاظ على طرف الإبرة في المحلول.

أدخل بعناية الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في السحاحة والمسمار حتى يضيق الإصبع. بعد ذلك ، باستخدام ممسحة حساسة خفيفة ، تمتص المحلول الذي يخرج من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي بسبب ضغط المكبس دون لمس طرف الإبرة. بعد ذلك ، أدخل السحاحة باستخدام حقنة معايرة في خلية العينة واربطها بإحكام.

لإعداد معلمات برنامج ITC، حدد التحكم في الأداة. اضبط معدل التحريك ودرجة الحرارة. ثم ضمن تفاصيل التجربة، أدخل المحقنة وتركيزات الخلايا بوحدات الملليمولار.

بعد ذلك، في القسم طريقة التجربة، حدد المعايرة بالتحليل الحجمي التدريجي. انقر فوق إعداد وحدد 20 حقنة من 2.5 ميكرولتر وإذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الدقة لمراقبة حدث الربط ، فقم بزيادة عدد الحقن وتقليل الحجم لكل حقنة. بعد ذلك ، أدخل التباعد الزمني بين كل حقنة بحيث يكون طويلا بما يكفي لتوازن الإشارة والعودة إلى خط الأساس ، عادة 300 ثانية.

ثم انقر على الزر تشغيل لبدء التجربة وتحديد مكان حفظ البيانات. تم إجراء معايرة Cu(II) في C-Peptide مما يدل على أن إضافة 150 ميكرومولار من Cu(II) تسبب في زيادة فورية في النطاق عند 600 نانومتر تعزى إلى النطاق d-d من Cu(II) واستمرت في الزيادة حتى تمت إضافة 300 ملليمولار Cu(II). إضافة أخرى فوق 300 ميكرومولار Cu(II) لم تزد امتصاص حظر d-d مما يشير إلى التشبع وأن Cu(II) يرتبط بالببتيد C في مركب 1: 1 مع قيمة سجل K أكثر من ستة.

تمت معايرة C-Peptide إلى ما يقرب من 10 مركب ميكرومولار من النحاس والفين وانخفض الامتصاص من نطاق نقل الشحنة عند 265 نانومتر مما يشير إلى أن C-Peptide كان قادرا على تخليب Cu(II) من رباط الفينانثرولين بقيمة سجل K من 7.4 إلى 7.8. يظهر مخطط الحرارة ITC معايرة 1.4 ملليمولار Cu (II) في 154 ميكرومولار C-Peptide في مخزن مؤقت MOPS 15 ملليمولار. وجد أن التقارب الملزم له قيمة سجل K تبلغ ثمانية مع تغير في المحتوى الحراري مثل 8 كيلوجول لكل مول.

جيبس الطاقة الحرة كما ناقص 46 كيلوجول لكل مول ، والتغير في الإنتروبيا كما 120 جول لكل مول لكل كلفن. المعايرة بالتحليل الحجمي التي يتم التحكم فيها من 1.4 ملليمولار Cu(II) إلى 15 ملليمولار MOPS المخزن المؤقت في غياب C-Peptide لا يظهر أي ارتباط في مخطط الحرارة. أود أن أقول التأكد من أن كل شيء نظيف.

إذا كانت هناك أيونات معدنية أو ببتيدات متبقية من التجارب السابقة ، فيمكن أن يؤثر ذلك بشكل كبير على قياس stoichiometry ويوفر منافسة غير معروفة في تجارب الربط. الديكروزم الدائري هو طريقة أخرى لدراسة تفاعلات الببتيد المعدني أو البروتين المعدني لأنه ينظر إلى الدائرية. يمكن لمطياف الكتلة أيضا استجواب هذه المجمعات من خلال النظر في التغيرات في الكتلة.

تم استخدام هذه المجموعة من التقنيات من قبل العديد من المختبرات التي تدرس أيونات المعادن التي تتفاعل مع الببتيدات أو البروتينات.