Name: فحص ميكانيكا فرقة الميوسين في حزم خيوط الأكتين باستخدام ملاقط بصرية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: اكتشف قياس ميكانيكا فرق الميوسين في حزم الأكتين باستخدام الملاقط البصرية. يتيح هذا البروتوكول دراسة ديناميكيات بروتينات المحركات بدقة عالية في السيتوبلازم.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل زمالة أبحاث مجلس طلاب الدراسات العليا بجامعة ميسيسيبي (OA) ، وجامعة ميسيسيبي سالي ماكدونيل باركسديل مع مرتبة الشرف (JCW ، JER) ، واتحاد منح الفضاء في ميسيسيبي تحت رقم المنحة NNX15AH78H (JCW ، DNR) ، وجمعية القلب الأمريكية تحت رقم المنحة 848586 (DNR).

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

تم إجراء دراسة في المختبر باستخدام ملاقط بصرية جنبا إلى جنب مع التصوير الفلوري للتحقيق في ديناميكيات مجموعات الميوسين التي تتفاعل مع خيوط الأكتين. تم تجميع حزم الأكتين-الميوسين-الأكتين باستخدام الميوسين العضلي الثاني، والأكتين الرودامين في الجزء السفلي من الحزمة وعلى سطح الغطاء، وخيوط الأكتين البيوتينيل ذات العلامات 488 في الجزء العلوي من الحزمة. تم بلمرة بروتين الأكتين من عضلة الأرانب وتثبيته باستخدام مخازن الأكتين العامة (GAB) ومخازن بلمرة الأكتين (APB). يجب إعداد GAB و APB طازجا كل يوم في المختبر باستخدام ATP...

البروتينات الحركية ضرورية للحياة ، وتحويل الطاقة الكيميائية إلى عمل ميكانيكي1،2،3. تتفاعل محركات الميوسين مع خيوط الأكتين عن طريق اتخاذ خطوات على طول الخيوط المشابهة للمسار ، وتقوم ديناميكيات شبكات الأكتين الميوسين بتنفيذ تقلص العضلات ، وحركية الخلية ، وحلقة الانقباض أثناء الحركية الخلوية ، وحركة البضائع داخل الخلية ، من بين المهام الأساسية الأخرى3،4،5،6،7،8 . نظرا لأن الميوسين له العديد من الأدوار الأساسية ، فإن الفشل في وظائف شبكة الميوسين أكتين يمكن أن يؤدي إلى تطور المرض ، مثل الطفرات في سلسلة الميوسين الثقيلة التي تسبب فرط انقباض القلب في اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) 9,10,11,12,13,14 . في تقلص العضلات ، تتعاون محركات الميوسين الفردية مع بعضها البعض من خلال العمل كمجموعة لتوفير الطاقة الميكانيكية المطلوبة التي تنفذ الانزلاق النسبي للتركيز البؤري التلقائي4،15،16،17،18. تشكل محركات الميوسين جسورا متقاطعة بين الرجفان الأذيني وتستخدم تغيرات متطابقة بسبب دورتها الميكانيكية الكيميائية للتحرك بشكل جماعي نحو الطرف الشائك للخيوط المحاذاة17،18،19،20،21.
وقد سهل تطوير مقايسات الحركة الكمية في المختبر على مستوى SM باستخدام تقنيات مثل الاصطياد البصري جمع تفاصيل غير مسبوقة عن كيفية عمل محركات الميوسين الفردية ، بما في ذلك قياس توليد قوة SM وأحجام الخطوات 22،23،24،25،26،27،28،29،30 . طور Finer et al. اختبار الاصطياد البصري "ثلاثي الخرز" أو "الدمبل" للتحقيق في ميكانيكا توليد القوة لمحركات myosin II المفردة23,31. نظرا لأن myosin II العضلي يعمل في فرق للتعاقد مع AFs ولكنه غير عملي على مستوى SM ، كان لا بد من إعادة ترتيب اتجاه فحص الاصطياد البصري من نهج الخرزة الكلاسيكية المرتبطة بالمحرك32. لتشكيل فحص الدمبل ، تم استخدام فخاخين بصريتين لتثبيت التركيز البؤري التلقائي فوق محرك الميوسين المرتبط بحبة متصلة بغطاء ، وتم قياس خرج القوة بواسطة المحرك الفردي من خلال حركات التركيز البؤري التلقائي داخل المصيدة23.
ومع ذلك ، فإن قوى SM واستخدام اتجاه فحص محرك واحد / خيط واحد لا يعطي صورة كاملة عن توليد القوة على مستوى النظام لأن العديد من البروتينات الحركية ، بما في ذلك الميوسين الثاني ، لا تعمل بمعزل عن بعضها البعض وغالبا ما لا تعمل كمجموع لأجزائها 15,16,17,32,33,34,35,36 . الهياكل الأكثر تعقيدا التي تشمل أكثر من محرك واحد يتفاعل مع أكثر من خيوط واحدة ضرورية لفهم أفضل للتآزر بين شبكات خيوط الميوسين والأكتين15,32. تم استغلال اتجاه فحص الدمبل للتحقيق في توليد قوة المجموعة الصغيرة من خلال وجود ميوسينات متعددة متصلة بحرزة أو باستخدام خيوط سميكة من الميوسين متصلة بسطح والسماح للمحركات بالتفاعل مع التركيز البؤري التلقائي المعلق 4,23,34,37,38,39,40.
تشمل اختبارات المجموعة الصغيرة الأخرى مقايسة انزلاقية في المختبر حيث يتم طلاء محركات الميوسين على سطح الغطاء ، ويتم استخدام حبة مرتبطة بالتركيز البؤري التلقائي للتحقيق في القوة الناتجة عن فريق المحركات 4,35,36,38,39,40,41,42,43 . في كلتا الحالتين ، ترتبط الميوسينات بسطح صلب - حبة أو غطاء - وتستخدم AF واحدا. في هذه الحالات ، لا تكون المحركات قادرة على التحرك بحرية أو التواصل مع بعضها البعض ، ولا يعكس وجود myosins مقيد بشكل صارم البيئة الهرمية المتوافقة التي ستعمل فيها المحركات معا في ساركومير32. وقد اقترحت دراسات سابقة أن الميوسين II يمكن أن يستشعر بيئته ويتكيف وفقا لذلك مع تغير ظروف التركيز اللزج المرن أو الحركي عن طريق تغيير الخصائص مثل توليد القوة ونسبة الواجب41،44،45. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تطوير اختبار الاصطياد البصري الذي يعزز ويلتقط اتصالات المحرك وتوافق النظام لرسم صورة أكثر واقعية للأسس الميكانيكية لتوليد قوة مجموعة الميوسين II.
هنا ، طورنا طريقة لإقران الهيكل الهرمي في المختبر مع الاصطياد البصري عن طريق تشكيل حزم أو سندويشات أكتوميوزين تتكون من محركات ميوسين متعددة تتفاعل بين اثنين من خيوط الأكتين. تتمتع هندسة المقايسة المعيارية هذه بالقدرة على التحقيق المباشر في كيفية تأثير العوامل الجزيئية والبيئية على توليد قوة الميوسين الجماعية. علاوة على ذلك ، فإن التحقيق في آليات توليد القوة من خلال مجموعات الأكتين الميوسين هذه لديه القدرة على المساعدة في نمذجة وفهم كيفية انتشار المهام الخلوية واسعة النطاق ، مثل تقلص العضلات ، من المستوى الجزيئي9،10،13.

<table><tbody><tr><td>بروتين الأكتين (البيوتين): الهيكل العظمي للعضلات</td><td>الهيكل الخلوي</td><td>AB07-A</td><td>بروتين الأكتين البيوتينيل</td></tr><tr><td>بروتين الأكتين ، العضلات الهيكلية للأرانب</td><td>الهيكل الخلوي</td><td>AKL99-A</td><td>بروتين الأكتين</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td> مثبت <td>الأكتين و Alexa Fluor 488 وصمة عار</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher العلمية</td><td>BP413-25</td><td>مطلوب للأكتين التجميع وحركية الميوسين</td></tr><tr><td>بيتا د-جلوكوز</td><td>فيشر</td><td>العلمي MP218069110</td><td>جزء من نظام كسح الأكسجين المستخدم لتقليل التبييض الضوئي أثناء التصوير الفلوري</td></tr><tr><td>مانع درجة النشاف (الكازين)</td> <td>Biorad</td><td>1706404</td><td>يستخدم لمنع السطح من الارتباط غير المحدد</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79500</td><td>كلوريد الكالسيوم ، يوفر التحكم اللازم في ديناميكيات شبكة الأكتين ميوسين</td></tr><tr><td>كاتالاز</td><td>فيشر العلمي</td><td>ICN10040280</td><td>جزء من نظام كسح الأكسجين المستخدم لتقليل التبييض الضوئي أثناء التصوير الفلوري</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544C</td><td>يستخدم لصنع خلايا التدفق</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher</td><td>العلمية AC327190010</td><td>تستخدم لإعداد</td></tr> <tr><td>العازلةالإيثانول</td><td>فيشر العلمي</td><td>A4094</td><td>ريجنت المستخدمة لتنظيف أغطية</td></tr><tr><td>الجلوكوز أوكسيديز</td><td>فيشر العلمية</td><td>34-538-610KU</td><td>جزء من نظام كسح الأكسجين المستخدم لتقليل التبييض الضوئي أثناء التصوير الفلوري</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>يستخدم لإعداد العازلة</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>يستخدم لحفر الأغطية وضبطها الرقم الهيدروجيني العازل</td></tr><tr><td>MgCl 2</td> <td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>يستخدم لإعداد شرائح</td></tr><tr><td>المجهر</td><td>العازلة فيشر العلمي</td><td>12-544-2</td><td>يستخدم لصنع خلايا التدفق</td></tr><tr><td>بروتين الميوسين الثاني: عضلة الهيكل العظمي للأرانب</td><td>الهيكل الخلوي</td><td>MY02</td><td>بروتين حركي الميوسين كامل الطول معزول من عضلة الهيكل العظمي للأرانب</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker / JPK</td><td>NT2</td><td>أداة الاصطياد البصري</td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>مرافق التصاق خيوط الأكتين على السطح الزجاجي للغطاء</td></tr> الهيكل <tr><td>الخلوي</td><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>PHDR1</td><td>مثبت أكتين وبقع الفلورسنت الرودامين</td></tr><tr><td>حبات Streptavidin ، 1 & mu ؛ m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>مقبض الاصطياد البصري</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR H5121</td><td>يستخدم لإعداد المخزن المؤقت</td></tr></tbody></table>

فحص ميكانيكا فرقة الميوسين في حزم خيوط الأكتين باستخدام ملاقط بصرية

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

الميوسينات هي بروتينات حركية تحلل ATP لتخطو على طول مسارات خيوط الأكتين (AF) وهي ضرورية في العمليات الخلوية مثل الحركة وتقلص العضلات. لفهم آليات توليد القوة الخاصة بهم ، تم التحقيق في الميوسين II على مستوى الجزيء الواحد (SM) وكفرق من المحركات في المختبر باستخدام الطرق الفيزيائية الحيوية مثل الاصطياد البصري.
أظهرت هذه الدراسات أن سلوك توليد قوة الميوسين يمكن أن يختلف اختلافا كبيرا عند الانتقال من مستوى الجزيء الواحد في ترتيب ثلاثي الخرز إلى مجموعات من المحركات التي تعمل معا على خرزة صلبة أو سطح غطاء في ترتيب انزلاقي. ومع ذلك ، فإن إنشاءات الفحص هذه لا تسمح بتقييم ديناميكيات مجموعة الميوسين داخل التسلسل الهرمي الهيكلي اللزج المرن كما تفعل داخل الخلية. لقد طورنا طريقة باستخدام ملاقط بصرية للتحقيق في ميكانيكا توليد القوة بواسطة مجموعات الميوسين التي تتفاعل مع خيوط الأكتين المتعددة.
تسهل حزم الأكتوميوس هذه التحقيق في بيئة هرمية ومتوافقة تلتقط الاتصالات الحركية وإخراج قوة المجموعة. تسمح الطبيعة القابلة للتخصيص للفحص بتغيير الظروف التجريبية لفهم كيف تؤدي التعديلات على مجموعة الميوسين أو حزمة خيوط الأكتين أو البيئة المحيطة إلى مخرجات قوة مختلفة.

تتميز خلايا التدفق التي تحتوي على أنظمة حزم الأكتوميوزين بتصميم قياسي ، وتتكون من شريحة مجهرية وغطاء محفور مفصول بقناة مصنوعة من شريط لاصق على الوجهين (الشكل 1). ثم يتم بناء الفحص من الغطاء إلى الأعلى باستخدام مقدمات مرحلية كما هو موضح في البروتوكول. يتكون الفحص النهائي من خيوط الأكتين الموسومة بالرودامين النموذجية. تركيز الميوسين المطلوب (تم استخدام 1 ميكرومتر للنتائج التمثيلية في الشكل 2 والشكل 3) ؛ البيوتينيل ، خيوط الأكتين اليكس...

يتم عرض ومناقشة تشكيل حزم أكتوميوزين في المختبر وقياس توليد قوة مجموعة الميوسين باستخدام ملاقط بصرية.

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

يعد التحقيق في سلوك الأكتين باستخدام هذا البروتوكول أمرا مهما لأنه يسمح للمستخدم بفحص ديناميكيات مجموعة البروتين الحركي باستخدام دقة الاصطياد البصري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على قياس ميكانيكا الميوسين داخل التسلسل الهرمي لبنية الأكتين ، على عكس الاتجاه التقليدي أحادي الخيط أحادي المحرك المستخدم في العديد من تجارب الاصطياد البصري. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي طبيعته المعيارية ، والتي تسمح للمستخدم بتخصيص الفحص لنظام الهيكل الخلوي الهرمي الذي يختاره.للبدء ، ضع قطعتين من الشريط اللاصق على الوجهين في منتصف شريحة المجهر على بعد ثلاثة إلى أربعة ملليمترات من بعضها البعض. ثم قم بتمزيق أو قطع الشريط الزائد المعلق على حافة الشريحة. بعد ذلك ، أضف زلة الغطاء المطلية ب PLL أعلى الشريط بشكل عمودي على المحور الطويل لشريحة المجهر لتشكيل قناة.باستخدام أنبوب صغير لضغط الغطاء ، انزلق على الشريط والمجهر ، حرك جيدا حتى يصبح الشريط شفافا ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات في الشريط لأن ذلك قد يتسبب في تسرب من قناة التدفق. أضف 15 ميكرولترا من أكتين الرودامين المخفف إلى خلية تدفق PLL وفتيل المحلول الزائد من خلال خلية التدفق ، لكن لا تسمح لقناة التدفق أن تجف. ثم احتضان لمدة 10 دقائق في غرفة الرطوبة.بعد ذلك ، قم بإعداد ملليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول الكازين في مخزن بلمرة الأكتين وأضف 15 ميكرولتر من المحلول لمنع الارتباط غير المحدد للمكونات اللاحقة. ثم احتضان لمدة خمس دقائق في غرفة الرطوبة. بعد ذلك ، أضف التركيز المطلوب من الميوسين إلى الأكتين المحضر بيوتينيل وتعليق الخرز وحركه برفق بطرف ماصة.ثم ، أضف على الفور 15 ميكرولتر من التعليق مع تركيز الميوسين المطلوب إلى خلية التدفق واحتضانه لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أغلق الأطراف المفتوحة لخلية التدفق بطلاء الأظافر لمنع التبخر أثناء التصوير وتجارب الاصطياد البصري. بمجرد أن يصبح النظام جاهزا ، قم بتشغيل الليزر باستخدام زر طاقة الليزر في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة إلى 50 ملي واط واتركه يستقر لمدة 30 دقيقة.انقر بالتتابع على أزرار الإضاءة والكاميرا والهدف وحركة المسرح داخل البرنامج لإظهار تلك النوافذ للعرض والتلاعب أثناء التجربة. قم بتشغيل إضاءة المجهر بالنقر فوق الزر تشغيل / إيقاف وضبطه على أقصى طاقة عن طريق النقر فوق الشريط وسحبه إلى اليمين. افتح منطقة العينة وأزل حامل العينة من مرحلة المجهر.ثم أضف خلية التدفق وقم بتثبيتها بحاملات العينات المعدنية ، مما يضمن أن زلة الغطاء في الأسفل. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من ماء التناضح العكسي إلى مركز الهدف السفلي وأعد إدخال مرحلة العينة. ثم ارفع الهدف السفلي باستخدام L2 على جهاز التحكم عن بعد حتى تلامس حبة الماء انزلاق الغطاء.بعد ذلك ، قم بخفض الهدف العلوي حتى يتم الوصول إلى حوالي نصف المسافة إلى خلية التدفق باستخدام R2 على وحدة التحكم عن بعد. بعد ذلك ، أضف 170 ميكرولترا من ماء RO إلى الجزء العلوي من خلية التدفق مباشرة أسفل الهدف العلوي وقم بخفض الهدف العلوي حتى يكسر التوتر السطحي للماء ويشكل هلالة. بعد ذلك ، حرك مرحلة المجهر باستخدام لوحة الأسهم الموجودة على وحدة التحكم عن بعد حتى يتم الوصول إلى حافة الشريط المجاور لقناة التدفق ثم أغلق باب العينة.باستخدام نافذة الهدف في الشاشة ، قم بإحضار حافة الشريط والتركيز عن طريق إحضار الهدف السفلي المسمى Laser Objective لأعلى بالنقر فوق السهم العلوي والهدف العلوي بالنقر فوق السهم السفلي باستخدام عناصر التحكم التي تظهر على الشاشة. ابحث عن حبة عائمة وحبسها بالنقر فوق زر غالق المصيدة ، والذي سيفتح الغالق ويسمح لليزر الملائمة بضرب العينة. ثم انقر فوق مؤشر الملائمة على الشاشة واسحبه لتحريك موقع ليزر الملائمة.بمجرد محاصرتها ، قم بمعايرة الخرزة بالنقر فوق زر المعايرة. ثم ، انقر فوق الإعدادات واكتب قطر الخرزة ودرجة حرارة المرحلة الموجودة في الجزء السفلي الأيسر من نافذة البرنامج. بعد ذلك ، انقر فوق Trap 1 ، ثم على X Signal وقم بإجراء ملاءمة تردد الزاوية بالنقر فوق تشغيل.ثم انقر واسحب داخل النافذة لتحسين ملاءمة الوظيفة. بعد ذلك ، انقر فوق استخدامه لقيم الحساسية والصلابة ثم اقبل القيم. بعد ذلك ، أغلق النافذة.ابحث عن حزمة أكتوميوسين من خلال البحث عن الخرز المرتبط ب AFs على سطح زلة الغطاء ومن خلال البحث عن كل من AFs الفلورية المترجمة بشكل مشترك. قم بتشغيل مصدر الضوء الأبيض واستخدم مكعب المرشح المناسب لتصوير كل خيوط أكتين عن طريق تدوير البرج. بمجرد التحقق ، قم بحبس الخرزة المرفقة بالخيوط العلوية للحزمة بالنقر فوق زر مصراع المصيدة.بعد ذلك ، قم بتسجيل البيانات بالنقر فوق زر راسم الذبذبات باستخدام عناصر التحكم التي تظهر على الشاشة. لتصور القياسات دون تسجيل البيانات ، انقر فوق ابدأ ثم انقر فوق الحفظ التلقائي لحفظ جميع البيانات. لتسجيل القياسات ، انقر فوق بدء التسجيل واختر البيانات التي سيتم تصورها في الوقت الفعلي عن طريق الاختيار من القائمة المنسدلة X Signal أو Y Signal.يظهر تتبع القوة لمحركات الميوسين الهيكلية التي تولد القوة داخل التسلسل الهرمي الهيكلي للأكتين في المختبر منحدرا ثابتا في القوة حتى يتم الوصول إلى الهضبة خلال دقيقتين إلى خمس دقائق. ومع ذلك ، لوحظ أيضا أن بعض حزم الأكتوميوسين التي لا تولد أي قوة محصلة وتظهر آثار القوة كضوضاء أساسية أو لا تظهر أي زيادة صافية كبيرة في القوة خلال 90 ثانية بسبب انخفاض تركيز المحرك أو الاتجاه الموازي غير المواتي للخيوط. سيمهد تطوير البروتوكول هذا الطريق نحو بناء فحوصات هيكلية خلوية أكثر تعقيدا في المختبر ستساعد بشكل أكبر في نمذجة المهام الخلوية واسعة النطاق ، مثل انقسام الخلايا وتقلص العضلات من الأسفل إلى الأعلى.

probing-myosin-ensemble-mechanics-actin-filament-bundles-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

هذا هو خطوة خطوة دليل يبين الغرض ، والعملية ، والنتائج ممثل عن مطياف قوة الجاذبية الرواية.

مما يدل على استخدامات مطياف الرواية قوة الجاذبية على التمدد وقياس البروتينات الليفية

هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.

التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر

يظهر هنا بروتوكول شامل لإجراء تجارب مشبك قوة فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة ، والتي يمكن تمديدها بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات العملية. يفصل البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليلها.

تشريح الخصائص الميكانيكية الأنزيمية للميوسينات العملية باستخدام التحليل الطيفي فائق السرعة لقوة المشبك

يقدم هذا البروتوكول سير عمل تجريبي كامل لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الملاقط البصرية. يتم تحديد العديد من الاجهزة التجريبية المحتملة بما في ذلك الجمع بين الملاقط البصرية مع المجهر confocal.

ملاقط بصرية لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين في تنظيم الترجمة

هنا ، نقدم بروتوكولا للتحقيق في الخواص الميكانيكية داخل الخلايا لخلايا الزرد الجنينية المعزولة في الحبس ثلاثي الأبعاد مع قياس القوة المباشرة بواسطة مصيدة بصرية.

قياسات القوة المباشرة للميكانيكا دون الخلوية في الحبس باستخدام ملاقط بصرية

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعادة تشكيل حزم الأنابيب الدقيقة في المختبر وتحديد القوى التي تمارس داخلها مباشرة باستخدام الاصطياد البصري المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي. يسمح هذا الفحص بقياس القوى والإزاحات الناتجة عن مجموعات البروتين داخل شبكات الأنابيب الدقيقة النشطة على مستوى النانو.

قياس القوى مباشرة داخل حزم الأنابيب الدقيقة النشطة المعاد تشكيلها

نحن نقدم بروتوكولات لفحوصات الموائع الدقيقة البسيطة لخيوط الأكتين ، بالاشتراك مع الفحص المجهري الفلوري ، والتي تسمح للمرء بمراقبة خيوط الأكتين الفردية بدقة في الوقت الفعلي مع تعريضها بالتتابع لحلول البروتين المختلفة.

استخدام الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري لدراسة ديناميكيات تجميع خيوط وحزم الأكتين المفردة

يقدم هذا البحث بروتوكولات لهندسة وتوصيف الشبكات المركبة ثلاثية الأبعاد القابلة للضبط لخيوط الأكتين المتشابكة والأنابيب الدقيقة. تخضع المركبات لإعادة هيكلة نشطة وحركة باليستية ، مدفوعة بمحركات الميوسين الثاني والكينيسين ، ويتم ضبطها بواسطة التركيزات النسبية للأكتين والأنابيب الدقيقة والبروتينات الحركية والوصلات المتشابكة السلبية.

إعادة تشكيل وتوصيف مركبات الأكتين-الأنابيب الدقيقة مع ديناميكيات وميكانيكا قابلة للضبط مدفوعة بمحرك

في هذا العمل ، تم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لدراسة المرونة المسامية لجل الأكتوميوسين في ظل ظروف خاضعة للرقابة. يتم تحديد ديناميكيات هلام actomyosin والمذيب المضمن ، والتي من خلالها يتم إثبات مرونة الشبكة المسامية. نناقش أيضا التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهميتها لميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.

ميكانيكا شبكات الأكتوميوسين المرنة (البورية) الانقباضية كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي

هنا ، نقدم طرقا لتحضير مجموعات الأكتين البلورية السائلة شبه ثنائية الأبعاد (2D) المتشابكة والمتشابكة والمتصالبة من البروتينات المنقاة.

ضبط أوضاع الانقباض والتشوه للتجميعات النشطة القائمة على الأكتين في المختبر: من الشبكات النشطة ثنائية الأبعاد إلى قطرات البلورات السائلة

اكتشف قياس ميكانيكا فرق الميوسين في حزم الأكتين باستخدام الملاقط البصرية. يتيح هذا البروتوكول دراسة ديناميكيات بروتينات المحركات بدقة عالية في السيتوبلازم.

فحص ميكانيكا فرقة الميوسين في حزم خيوط الأكتين باستخدام ملاقط بصرية

استكشف المزيد من الفيديوهات