التحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في الأدمغة الواضحة
مارس 31, 2022
يسمح الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وتطهير الدماغ باستخدام طريقة CLARITY بالتحقيق في عدد كبير من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وقت واحد.
تقنية الوضوح التي تم وصفها لأول مرة في عام 2013 هي تقنية إزالة الأنسجة التي تمكن من أخذ عينات من كميات أكبر من الخلايا والأوعية الدموية ، لذلك حتى البروتينات مثل دقة الخلية الواحدة في شرائح الدماغ السميكة. تمكن هذه التقنية من دراسة الهياكل المجهرية السليمة عن طريق جعل الدماغ بأكمله شفافا. هذا البروتوكول عبارة عن شريحة بسيطة وخط أنابيب مباشر لتنظيف الأنسجة.
يمكن استخدام هذه التقنية لتطهير الأنسجة في أنظمة أخرى بالإضافة إلى أنسجة المخ. للبدء ، قم بإغلاق الأنبوب والغطاء باستخدام parafilm وثقب ثقبين في الغطاء. ثم انقل غاز النيتروجين من الخزان باستخدام أنبوب مرن بقطر داخلي يبلغ خمسة ملليمترات وإبرة قياس 19 متصلة في نهايته.
ابدأ في إزالة الغاز عن طريق توصيل الأنبوب بالأنبوب والسماح بتبادل الغاز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. افصل الأنبوب وأغلق الثقوب على الفور باستخدام طين النمذجة. ثم انقل الأنابيب المختومة بالديغا إلى حمام 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ونصف الساعة لبلمرة محلول الهيدروجيل.
أخرج الدماغ من الأنبوب. باستخدام مناديل المختبر، قم بإزالة الهيدروجيل المبلمر حول الدماغ لضمان عدم بقاء أي جل متبقي ملتصقا بسطح الدماغ. قسم الدماغ إلى شرائح سميكة تحتوي على جميع مجالات الاهتمام.
ضع الشرائح في محلول المقاصة الأول واحتضنها عند 37 درجة مئوية مع الدوران عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. في غضون ذلك ، قم بإعداد أنبوب مثقب لوضع الدماغ. ضع الأنبوب المثقب في كوب مملوء بمحلول إزالة ثان على جهاز تحريك.
ثم ضع الدماغ في الكأس وختمه بورق الألومنيوم لمنع التبييض. بعد أن يصبح النسيج شفافا ، انقل الدماغ إلى PBST في حضانة عند 37 درجة مئوية مع دوران عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. استبدل المحلول ب PBST طازج واستمر في الحضانة لمدة 24 ساعة أخرى.
ثم انقل الدماغ إلى PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الدماغ من PBS ونقله إلى محلول مطابقة معامل الانكسار. احتضان الدماغ عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
أولا، ضع العينة في منتصف الشريحة. باستخدام الغراء الساخن ، قم بإنشاء جدران على حواف الشريحة ، تقريبا مثل الأنسجة. تأكد من ترك فجوة صغيرة في أحد الزوايا.
عندما تقترب طبقة الغراء الساخن من ارتفاع شريحة الدماغ ، ضع قطرة إلى قطرتين من محلول مطابقة معامل الانكسار على العينة لترطيب السطح العلوي ومنع تكوين الفقاعة. بينما لا يزال الغراء الساخن سائلا ، أغلق الجزء العلوي بزلة غطاء ، وضعه بالتساوي قدر الإمكان ثم املأ الغرفة بمحلول مطابقة معامل الانكسار. أغلق الفجوة بالغراء الساخن.
إذا امتدت جدران الغراء الساخن خارج حدود الشريحة ، فقم بقطع الحواف الممتدة. إذا تم استخدام هدف غمر الزيت للتصوير ، فأضف من اثنين إلى ثلاثة ملليمترات أخرى من الغراء إلى الجدران فوق الغطاء للاحتفاظ بمحلول الغمر. بعد هذا البروتوكول ، سيتم مسح أنسجة المخ.
تم إعداد شرائح دماغية واضحة باستخدام هذا البروتوكول لتصور مجموعات من الخلايا النجمية والخلايا العصبية في منطقة CA1 من الحصين الفأر. عبرت جميع الخلايا النجمية عن tdTomato وعبرت الخلايا العصبية المثيرة عن H2B-GFP في نواتها. كانت الغرفة المعدة للأنسجة المصفاة مثالية للتصوير تحت فوتون اثنين أو مجهر بؤري.
باستخدام مجهرين فوتونيين ، تم رصد أكثر من 300 خلية نجمية في قسم واضح من منطقة CA1 من الحصين الفأر. كانت الخلايا النجمية الحصين في الخلايا الحمراء والهرمية ، والسوماتا باللون الأخضر مرئية وسميكة وشفافة تمثل القرب المكاني بين هذين النوعين من الخلايا. باستخدام المجهر البؤري بالليزر الماسح ، تم تتبع الحزم المحورية من الخلايا العصبية المثيرة عبر نصف الكرة الأرضية بأكمله.
تم تتبع الحزم الخضراء من الحصين الظهري نحو الأجسام الثديية الفائقة. تم تتبع الحزم الحمراء من أجسام الثدييات نحو أصلها في الحصين تنفيس. أثرت العوامل ، مثل درجة الحرارة والتركيزات ووقت الحضانة على نتيجة إجراء الوضوح.
لذلك ، فإن الدقة في كل خطوة من خطوات البروتوكول أمر حيوي لنجاح تحقيق أنسجة واضحة. باستخدام هذه التقنية ، نقيس المسافات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية في العديد من هياكل الدماغ. سمح هذا البروتوكول بتحليل اثنين إلى ثلاثة من الخلايا ذات الحجم أكثر مما كان عليه في الدراسات السابقة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستخدم هذه الدراسة طريقة CLARITY المدمجة مع التحويل الفيروسي لدراسة العلاقات المكانية بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية في قرن آمون للفأر. من خلال جعل الأنسجة شفافة، تتيح هذه التقنية للباحثين دراسة عدد أكبر من الخلايا، مما يكشف عن رؤى حول التنظيم الخلوي والتفاعلات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تقنيات تخليص الأنسجة
- التصوير الخلوي
الخلفية
- تتيح تقنية CLARITY تصور أنسجة الدماغ على المستوى الخلوي.
- تسمح بتحليل أعداد كبيرة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في الأنسجة السليمة.
- تعزز هذه الطريقة وضوح شرائح الدماغ السميكة مقارنة بطرق التصوير التقليدية.
- تشدد الدراسة على دور شفافية الأنسجة في فهم البنية العصبية.
غرض الدراسة
- للتحقيق في العلاقات البنيوية بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في قرن آمون للفأر.
- لقياس المسافات بين أنواع مختلفة من الخلايا عبر هياكل الدماغ المختلفة.
- لإظهار فعالية طريقة CLARITY للتصوير الخلوي.
الطرق المستخدمة
- استخدمت الدراسة طريقة CLARITY لتخليص الأنسجة في شرائح الدماغ.
- استخدمت أنسجة قرن آمون للفأر لتصور الخلايا النجمية والخلايا العصبية الإثارة.
- لم يتم ذكر أي مسارات عمل متعددة الأبعاد.
- تضمنت الخطوات الرئيسية إزالة الغاز، وبلمرة الهايدروجيل، والاحتضان في محاليل التخليص.
- تم تصوير الأنسجة باستخدام الميكروسكوب ثنائي الفوتون والميكروسكوب المجسم.
النتائج الرئيسية
- تم تصور أكثر من 300 خلية نجمية في أقسام قرن آمون المفرغ.
- تم تحديد السياق المكاني للخلايا النجمية والخلايا العصبية الإثارة، مما أظهر قربها.
- كانت هناك ملاحظات مهمة للحزم المحورية بين السكان العصبية في الأنسجة المفرغ.
- أثرت عوامل مختلفة على وضوح الأنسجة، مما سلط الضوء على الحاجة إلى منهجية دقيقة.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة أن طريقة CLARITY يمكن أن تعزز بشكل كبير من تصور العلاقات الخلوية في الدماغ.
- تتيح النتائج فهمًا أفضل للتنظيم المكاني للخلايا العصبية والخلايا الدبقية.
- الرؤى المكتسبة من هذه الطريقة قد يكون لها آثار على البحث في الآليات العصبية ونماذج الأمراض المحتملة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of astrocyte-neuron spatial interactions in intact brain tissue addresses a critical gap in early CNS target validation and mechanistic de-risking. The integration of viral vector labeling with CLARITY tissue clearing enables quantitative, large-scale analysis of cellular domains, supporting predictive confidence in neurobiological discovery. This capability enhances portfolio triage by providing robust, scalable data on cell-type interactions relevant to disease modeling and target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of astrocyte-neuron spatial relationships in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular domain boundaries and proximity metrics.
- Facilitates functional target validation through genetically defined cell-type labeling and imaging.
- Provides high-content data for predictive confidence in CNS target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact brain tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative spatial measurements.
- Enables scalable imaging of hundreds to thousands of cells per sample for robust screening.
- Supports assay development for compound evaluation targeting neuron-glia interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial mapping outputs with disease-relevant CNS models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by providing quantitative benchmarks for cell-type interactions.
- Supports biomarker discovery through high-resolution mapping of cellular domains.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neurobiology portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content spatial analysis of genetically defined brain cell populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on astrocyte-neuron interactions and clarifies mechanistic pathways in CNS tissue.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers cell proximity and domain occupancy metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects spatial mapping data to disease models and biomarker strategies when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue clearing and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector transduction, tissue clearing, and advanced microscopy.
- Demands access to two-photon or confocal imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates strict protocol standardization for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or model systems.
- Protocol precision is critical; temperature, reagent concentrations, and timing directly affect data quality.
