توصيف التهاب الصفاق الإنتاني الناجم عن السالمونيلا التيفيموريوم في الفئران

الإنتان هو استجابة مناعية للمضيف غير منظم للغزو الميكروبي أو تلف الأنسجة ، مما يؤدي إلى إصابة الأعضاء في موقع بعيد عن موقع العدوى أو الضرر. أصبح عامة الناس أكثر وعيا بهذا الاضطراب ، خلال جائحة COVID-19. في عام 2017 ، كان هناك 48.9 مليون حالة إنتان ، و 11 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم ، وهو ما يمثل حوالي 20٪ من جميع الوفيات العالمية.

وكما هو متوقع، فإن معظم الحالات موجودة في المستشفيات. في الواقع ، وجدت دراسة أن ما يقرب من 62 ٪ من العزلات الإيجابية من المرضى في وحدات العناية المركزة مع الإنتان ، كانت كائنات سالبة الجرام. هناك العديد من النماذج ، وبعض نماذج الفئران شائعة الاستخدام من الإنتان تشمل تسمم الدم الداخلي الناجم عن LPS ، ونموذج ربط وثقب cecal ، وأنظمة نموذج العدوى أحادية البكتيريا.

في مختبرنا ، قمنا بتوحيد نظام نموذج الماوس ، للحث على الإنتان البريتوني باستخدام السالمونيلا التيفيموريوم. هذا النموذج مفيد على غيره ، حيث أن السالمونيلا التيفيموريوم هي عامل ممرض داخل الخلايا يحاكي الحالة ذات الصلة سريريا للإنتان سالب الجرام. نتيجة تعفن الدم في التهاب الصفاق في هذا النموذج ، جهازية مع وفيات 100 ٪ ، في غضون 96 ساعة بعد الإصابة.

لذلك ، هذا النموذج مفيد في دراسة استجابات المضيف الالتهابي. في هذا النموذج ، يتم تحفيز الإنتان عن طريق حقن 0.5 مليون CFU داخل الصفاق من السالمونيلا التيفيموريوم ، في فأر C57BL / 6 عمره 8-10 أسابيع. يمكن تأكيد العدوى الجهازية ، من خلال تقييم العبء البكتيري للأعضاء ، بعد حوالي 16 ساعة من الإصابة.

تتطلب التجارب التي تستخدم السالمونيلا التيفيموريوم منشأة BSL-2 ، والالتزام بإرشادات BSL-2. يجب توخي الحذر لاستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، وضمان السلامة ، واتباع طرق التخلص من المخاطر البيولوجية BSL-2 القياسية. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية.

إعداد ثقافة السالمونيلا التيفيموريوم. أضف مائة ميكرولتر من مخزون الجلسرين Salmonella Typhimurium NCTC 12023 ، إلى 3 مل من مرق LB. احتضان الثقافة بمعدل 160 دورة في الدقيقة ، عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

قم بكتابة 50 ميكرولتر من الثقافة المزروعة بين عشية وضحاها في مرق LB ، على طبق السالمونيلا شيجيلا أجار ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. اختر مستعمرة واحدة من لوحة SS agar المخططة ، باستخدام microtip. أخرج الطرف الصغير إلى 3 مل من مرق LB ، واستزرع عند 160 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

أضف 0.1 مل من الثقافة البكتيرية إلى 50 مل من مرق LB ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية ، في حاضنة اهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة ، لمدة ثلاث إلى أربع ساعات ، للوصول إلى المرحلة اللوغاريتمية للنمو. تمييع الثقافة بعامل اثنين باستخدام مرق LB. قياس الكثافة البصرية للاستزراع عند 600 نانومتر طول موجي للضوء في مقياس الطيف الضوئي.

بمجرد أن يصل OD إلى واحد ، قم بعمل اثنين من الأليكوت من 1 مل من الثقافة ، في أنابيب microfuge 1.5 مل. الطرد المركزي للأنابيب في 7،750 غرام لمدة 15 دقيقة. تخلص من هذا السوبرناتانت ، واغسل الكريات ب 1 مل من 1XPBS مرتين.

الطرد المركزي للأنابيب في 7،750 غرام لمدة 15 دقيقة. أعد تعليق الكريات في 0.5 مل من 1XPBS ، في أنبوبين مختلفين 1.5 مل microfuge. اجمع بين المعلقات من كلا الأنبوبين ، في أنبوب واحد سعة 1.5 مل ، يحتوي الآن على ما يقرب من اثنين مضروبين في 10 مرفوعين إلى الطاقة ثماني وحدات لتشكيل مستعمرة لكل مل.

قم بإعداد تعليق خلية بكتيرية من 10 طاقة ستة CFU / mL ، عن طريق تخفيف محلول المخزون. ملاحظة مهمة ، قم بتحسين CFU المقابلة ل OD في مختبرك ، لتحديد CFU ل OD one ، قبل بدء التجارب. الفئران والالتهابات.

في يوم العدوى ، أمسك الفأر بيد واحدة ، وامسح جلد البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وانشر الساقين الخلفيتين لتحسين الوصول إلى جدار البطن. حقن 0.5 مل من 10 مرفوعة إلى الطاقة ستة CFU / مل تعليق بكتيري داخل الصفاق ، بمساعدة حقنة 1 مل. بعد الإصابة ، قم بلوحة الثقافة للتحقق من حقن CFU الفعلي ، والذي قد يختلف من 0.2 إلى 0.8 مليون CFU لكل 0.5 مل.

تقييم CFU للأعضاء. تم التضحية بالفأر باستخدام اختناق ثاني أكسيد الكربون. بعد التضحية بالفأر المصاب ، امسح البطن بقطعة من القطن ، مغموسة في 70٪ من الإيثانول.

قطع فتح الجلد البطني. ارجع إلى مقالة Ray and Dittle ، للحصول على بروتوكول فيديو ، حول كيفية جمع سائل الغسل البريتوني. قطع فتح تجويف الصفاق وجمع الجهاز محل الاهتمام.

في هذا الفيديو ، نوضح تعداد CFU العضو من الكبد. يخضع الكبد لأضرار نسيجية مرضية واسعة النطاق ، في هذا النموذج من الإنتان. قطع قطعة صغيرة من الكبد ووضعها في أنبوب microfuge.

يمكن تخزين هذا في الجليد لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات ، قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. قم بوزن القطعة ونقلها إلى أنبوب microfuge. يفضل قطع القطع التي تزن حوالي 10 إلى 15 ملغ ، من أجل التجانس السليم.

أضف 0.5 مل من 1XPBS في الأنبوب وقم بتجانس الأعضاء باستخدام مجانس يدوي. تأكد من أن الأعضاء متجانسة تماما. اصنع الحجم إلى 1 مل ، عن طريق إضافة 0.5 مل من 1XPBS.

الطرد المركزي للأنابيب عند 200 غرام لمدة خمس دقائق، عند أربع درجات مئوية. جمع supernatant في أنابيب microfuge جديدة. قم بإعداد تخفيفات من 10 إلى الطاقة ناقص واحد ، و 10 إلى الطاقة ناقص اثنين ، في لوحة بئر 96.

انشر 50 ميكرولتر من المخفف ، على ألواح SS agar الطازجة ، واحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. احسب عدد المستعمرات التي تظهر في كل شرط، وقم بتطبيع البيانات مع وزن العضو، باستخدام الصيغة التالية. CFU / mg يساوي عدد المستعمرات ، مضروبا في 20 ، مضروبا في عامل التخفيف ، مقسوما بالكامل على وزن العضو بالملغ.

لاحظ أن الرقم 20 يستخدم في الصيغة، لتحويل المستعمرات لكل لوحة إلى CFU/mL. يتم التوصل إلى هذا الرقم ، عن طريق قسمة 1 مل من كمية حجم معين من الثقافة المطلية. في هذه الحالة ، 50 ميكرولتر.

على سبيل المثال ، إذا وجدت مائة مستعمرة في صفيحة SS agar ، حيث ينتشر 50 ميكرولتر من 10 طاقة ناقص تمييع واحد للعضو المتجانس ، ويزن 10 ملغ ، ثم CFU / mg سيكون مساويا ل 100 مضروبا في 20 ، مضروبا في 10 ، مقسوما على 10 ، وهو ما يساوي 2000 CFU / mg. تحليل التدفق الخلوي لمختلف مجموعات الخلايا المناعية في الإفرازات البريتونية. جمع الخلايا البريتونية كما هو موضح سابقا ، بواسطة Ray و Dittle.

إعادة تعليق بيليه الخلية من سائل غسل الصفاق ، في 1 مل من RPMI مع استكمال 10 ٪ FBS. تعداد إجمالي أعداد الخلايا في الغسيل البريتوني ، باستخدام مقياس الدم. اضبط رقم الخلية بطريقة تجعل كل أنبوب يتلقى اثنين إلى خمسة مضروبين في 10 مرفوعين إلى خلايا الطاقة الخمسة.

قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 200 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبرناتانت. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1XPBS.

الطرد المركزي للخلايا في 200 غرام لمدة 10 دقائق. حظر مستقبلات Fc باستخدام مانع FCR. واحد هو 400 تخفيف ، أعدت في المخزن المؤقت حجب ، وتتكون من 5 ٪ FBS و 0.02 ٪ أزيد الصوديوم في PBS.

احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. الطرد المركزي للخلايا في 200 غرام لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبرناتانت.

تمييع الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم ذات الأهمية في منع المخزن المؤقت. هنا ، نستخدم واحدا هو تخفيف 500 من Ly6G المضاد للفأر ، لتلطيخ العدلات. لاحظ أنه يمكن أيضا عرض مجموعات الخلايا المناعية الأخرى ، باستخدام مضادات الفئران B220 للخلايا البائية ، و CD3 المضادة للفئران للخلايا التائية ، والمضادة للفأر F4/80 للبلاعم ، وما إلى ذلك.

احتضان حوالي 0.2 مليون خلية في 200 ميكرولتر من المحاليل المخففة للأجسام المضادة ، في أنابيب منفصلة. كعنصر تحكم سلبي ، ضع جانبا أنبوبا واحدا في كل نوع من أنواع الفلوروكروم ، للتحكم غير الملطخ. في هذا الأنبوب ، احتضن الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع بدون أجسام مضادة.

احتضن العينات على الجليد لمدة 45 دقيقة ، مع النقر المتقطع كل 15 دقيقة. الطرد المركزي للخلايا في 200 G لمدة 10 دقائق ، في أربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.

إصلاح الخلايا مع 4 ٪ paraformaldehyde لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، إذا لزم الأمر لتخزينها لعدة أيام. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من مخزن تلطيخ FACS ، 2٪ FBS في PBS. الحصول على البيانات في مقياس التدفق الخلوي.

تشير صور لوحات SS agar الموضحة هنا إلى عبء CFU العضوي في الكبد والطحال من الفئران الإنتانية. انتشر العضو المتجانس Lys6 عند تخفيف 10 إلى الطاقة ناقص واحد ، وتم تحضينه عند 37 درجة مئوية. ظهرت مستعمرات S.Typhimurium ذات المصبوغ الأسود بعد حوالي 12 ساعة من الحضانة.

يظهر جزء من اللوحة هنا كمجموعة مكبرة لتسليط الضوء على المستعمرات. تشير هذه النتائج إلى أن العامل الممرض انتشر بنجاح بشكل منهجي ، واستعمر الأعضاء الداخلية. يوضح هذا الشكل الأمصال المعزولة عن الفئران الصحية والصرف الصحي.

حجم الدم القابل للجمع من الفئران الإنتانية أقل من الضوابط الصحية ، وبالتالي فإن المصل الذي تم الحصول عليه أقل. يحدث هذا بسبب زيادة التخثر في الإنتان. أيضا الأمصال من الفئران الصرف الصحي ، تظهر تلوينا أحمر متميزا ، مما يشير إلى حدوث انحلال الدم على نطاق واسع.

يوضح الشكل مخططات القياس الخلوي للخلايا البريتونية من الفئران السليمة والصرف الصحي ، الملطخة بالأجسام المضادة المضادة ل Ly6G. هذه الصور تمثل فأرة واحدة سليمة واثنين من الفئران المصابة. شهدت الفئران الإنتانية زيادة في تسلل العدلات إلى التجويف البريتوني.

في هذا الفيديو ، أظهرنا طريقة لتحفيز الإنتان البكتيري في الفئران ، عن طريق الحقن داخل الصفاق من السالمونيلا التيفيموريوم. هذا نموذج مفيد لدراسة آثار التدخلات العلاجية في تخفيف الإنتان. في هذا النظام النموذجي ، يتغير التركيب الخلوي للتجويف البريتوني بشكل كبير من أجل مكافحة العامل الممرض.

لذلك ، فهو نموذج مفيد ، في دراسة التغيرات الحركية في تركيبات الخلايا المناعية ووظائفها أثناء الإنتان. النموذج مفيد أيضا في فهم الزيادة في أنواع الأكسجين التفاعلية بين الخلايا ، ومستويات السيتوكين المؤيدة للالتهابات ، وانحلال الدم ، وتخثر الدم ، وكلها تحدث أثناء الإنتان.