التصوير الكيميائي متعدد الإرسال القائم على مجهر رامان لتشتت رامان المحفز عريض النطاق

نقدم بروتوكولا للحصول على صور كيميائية باستخدام مجهر تفريق رامان (SRS) المحفز عريض النطاق. استنادا إلى مجهر SRS الذي يعمل مع الكشف التفاضلي متعدد القنوات ، يصف البروتوكول إعداد العينة ، وتعديل جهاز SRS ، والقياسات الكيميائية لفك تشابك المكونات المختلفة للعينات غير المتجانسة كيميائيا.

يصف بروتوكولنا كيفية بناء مجهر رامان المبعثر المحفز ، والذي يمكن من قياس الطيف الاهتزازي للجزيئات في غضون ميكروثانية. وعند تطبيقه على التصوير ، يمكن أن يوفر الفحص المجهري الطيفي الفائق لتحديد موقع المكونات الكيميائية للمادة وتحديدها كميا بطريقة خالية من الملصقات وغير جراحية. هناك العديد من التطبيقات لهذا البروتوكول ، وخاصة في العلوم البيولوجية والطبية الحيوية.

على سبيل المثال ، لتصوير الخلايا أو الأنسجة. هناك تحديان مهمان لنهجنا ، المصدر البصري عريض النطاق وسلسلة الكشف. لمعالجة الأول ، يمكن للمرء شراء OPR أو بناء واحد بنفسك.

بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام الضوء الأبيض supercontinuum المتولد في بلورات السائبة أو في الألياف البصرية غير الخطية. يمكن معالجة التحدي الأخير عن طريق المسح المتسلسل لكل مكون طيفي باستخدام صمام ثنائي ضوئي تجاري وماسح ضوئي galvo للبدء ، قم باستخراج ميكرولترين من تعليق مائي من بولي ميثيل ميثاكريلات ، أو ميكروبيدات PMMA ، وصب التعليق على زلة غطاء المجهر. بعد ذلك ، قم باستخراج ميكرولترين من تعليق مائي لميكروبيدات البوليسترين ودمجها مع تعليق PMMA على زلة الغطاء.

امزج التعليق بلطف مع طرف ماصة واتركه يجف لمدة 24 ساعة. ستظهر طبقة بيضاء من الخرز أعلى الغطاء عندما يجف الماء. أضف 20 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 20 ميكرولتر من زيت الزيتون النقي فوق الغطاء الزجاجي.

وتطبيق طلاء الأظافر على حواف زلة غطاء المجهر الثاني. ضع الغطاء على الخليط ، مع توجيه طلاء الأظافر لأسفل ، وتطبيق ضغط كاف لإغلاقه. اتركه يجف.

لتحسين كفاءة التشكيل لشعاع ستوكس ضيق النطاق. قم بتغيير المسافة بين العدستين F1 و F2 ، وقم بقياس الشعاع المعدل باستخدام صمام ثنائي ضوئي. ثم قم بتسجيل ملف التعريف الخاص به باستخدام منظار الذبذبات.

اضبط طول تجويف المذبذب البارامتري البصري بطريقة تمكن طيف مضخة النطاق العريض الناتج ، إلى جانب Stokes ضيق النطاق عند 1040 نانومتر ، من إنتاج فك ضبط التردد في حدود 2،800 إلى 3،100 سنتيمتر عكسي. يغطي هذا النطاق الطيفي اهتزازات منطقة تمدد CH. أرسل مضخة النطاق العريض إلى ضاغط منشور للتعويض عن تأثيرات التشتت التي يتضمنها هدف مجهر الإثارة.

أدخل المضخة في المنشور A ، من خلال قمتها ، وقم بتوجيه المضخة المشتتة نحو قمة المنشور B.حدد مقدار التشتت السلبي اللازم واضبط المسافة بين فتحات المنشور وفقا لذلك. استخدم منشورات بروستر المقطوعة ، وتأكد من أن استقطاب شعاع المضخة يقع داخل المستويات المثلثة للمنشورات. لتحسين مخطط الكشف المتوازن المضمن ، اضبط المحور السريع لهذا الكريستال العمودي ثنائي الانكسار ، وقم بتوجيه المضخة المستقطبة إلى لوحة YV04 بطول 13.3 ملم.

ثم استخدم صفيحة نصف موجة لضبط استقطاب شعاع المضخة على 45 درجة. اجمع بين المضخة وعوارض ستوكس مع مرآة ثنائية اللون وقم بمحاذاتها بعناية مع زوج من الثقوب الفلورية. تأكد من أن كلا الحزمتين تنتشران خطيا مشتركا.

تخفيف الحزم وتوجيهها إلى صمام ثنائي ضوئي سريع لتداخلها مؤقتا. بعد ذلك ، قم بإزالة الصمام الثنائي الضوئي. بعد ذلك ، قم بقياس ملفات تعريف الشعاع باستخدام كاميرا معايرة ، واستخدم بطاقة الأشعة تحت الحمراء لتقدير الأقطار بالعين.

استخدم تلسكوبين. واحد للمضخة وآخر لشعاع ستوكس ، وحاول مطابقة أقطار الشعاع مع الفتحة الخلفية لهدف الإثارة. بمجرد الحصول على تشتت رامان المحفز ، أو إشارة SRS ، استخدم التلسكوب الموجود على شعاع المضخة لتعديل قطره ، وتغيير نطاق Rayleigh ، وبالتالي حجم التفاعل في تركيز المجهر.

توقف عند تحقيق الحد الأقصى ل SRS. استخدم الصمام الثنائي الضوئي لقياس شدة شعاع المضخة، ومع مسؤولية الصمام الثنائي الضوئي، احسب متوسط الطاقة التي تؤثر على المنطقة النشطة للكاشف. لقياس ضوضاء الكثافة النسبية لليزر، افصل مرشح التمرير المنخفض وقم بتوصيل مخرج الصمام الثنائي الضوئي ذي النطاق الترددي العالي بإدخال مضخم صوت القفل.

قم بتخزين خرج القفل بالفولت فوق الجذر التربيعي ل Hertz عند ترددات إزالة الديمودلات المختلفة واستخدم مسؤولية الثنائيات للصور لتحويل الفولت إلى واط. قم بتوجيه المضخة وعوارض ستوكس إلى المجهر. ضع العينة وابحث عن منطقة خالية من الخرز للمساعدة في محاذاة شعاع المضخة.

ثم ، اجعل أهداف الإثارة والجمع مختلطة. ضع مرشح ممر قصير لإزالة ستوكس المعدل وتوجيه شعاع المضخة إلى الدرجات. ضع عدسة بعد التدرج لتركيز الشعاع المشتت على أجهزة الكشف.

للكشف المتوازن ، قم بقياس طيف المرجع والنسخ المتماثلة للإشارة التي تنتشر على طول شعاع المضخة. ضع شقا صغيرا، أو قزحية، بين التسوية وفاصل شعاع الاستقطاب، لضمان التطابق الطيفي بين صفيفي الصمام الثنائي الضوئي ولتصفية المضخة المشتتة مكانيا. قم بقص جميع المكونات الطيفية للنسخ المتماثلة للمضخة باستثناء مكون واحد لتوسيط الأشعة المرسلة على كاشف Nth لمصفوفات الصمام الثنائي الضوئي المرجعية والإشارة.

استخدم مرايا التوجيه لضبط ارتباط قنوات الكشف المختلفة. لبدء الفحص المجهري SRS: قم بتعديل ستوكس ، ومسح العينة ضوئيا نقطا ، والحصول على نقل التشكيل على طيف المضخة مع طيف DC المقابل له للحصول على طيف SRS العادي من كل بكسل. قم بإنتاج مصفوفات ثلاثية الأبعاد تحتوي صفوفها وأعمدتها على المواضع الممسوحة ضوئيا للعينة.

على كل متجه متعامد على مستوى XY ، قم بتخزين طيف SRS. ارسم التركيز والملامح الطيفية للحصول على الصور الكيميائية والأطياف المميزة للمكونات الكيميائية للعينة. توضح الصورة التمثيلية أطياف الضوضاء ذات الكثافة النسبية للمصادر البصرية المستخدمة في هذا البروتوكول.

تظهر هنا أفضل منطقة طيفية لتجارب SRS. يضمن تعديل شعاع ستوكس على أي تردد داخل هذا النطاق أن تكون تأثيرات ضوضاء الليزر على إشارة SRS هي أدنى مستوى ممكن. تظهر هنا بيانات نموذجية للأطياف غير المتوازنة والمتوازنة.

تؤثر آثار الكشف المتوازن على النتائج النهائية للتجارب. وهي الخرائط الكيميائية. تظهر الصور المركبة في الظروف غير المتوازنة والمتوازنة هنا.

تظهر الصور التمثيلية تحليلا كيميائيا لبيانات SRS فوق الطيفية. ويظهر هنا مركب من خرائط التركيز للمكونات الكيميائية المختلفة للعينة وأطياف SRS المميزة لها. من هذه البيانات ، يمكن بسهولة تحديد المكونات المختلفة للعينة ، على سبيل المثال ، زيت الزيتون والبوليسترين DMSO والبولي ميثيل ميثاكريلات.

حاليا ، يمكن لتقنيتنا فقط التحقيق في تمدد اهتزاز CH. ومع ذلك ، من خلال تحسين المصدر البصري ، ستسمح لنا سلسلة الكشف نفسها باستكشاف منطقة بصمات الأصابع الأكثر إفادة التي تكتشف عدة أوضاع في وقت واحد. تمهد سلسلة الكشف الخاصة بنا الطريق لدمج SRS عريض النطاق في العيادات ، وإدخال تقنية من شأنها أن تكمل وتعزز سير العمل التقليدي لعلم الأنسجة المرضي لتشخيص الأنسجة.