تنقية البروتين المحدد من نوع الخلية والتعرف عليه من الأنسجة المعقدة باستخدام خط ماوس الميثيونين tRNA Synthetase الطافر
أبريل 13, 2022
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء وضع العلامات على البروتين الخاص بنوع الخلية باستخدام أزيدونونورليوسين (ANL) باستخدام خط ماوس يعبر عن سينثيتاز L274G-Methionine tRNA المتحور (MetRS *) والخطوات اللازمة لعزل البروتينات الخاصة بنوع الخلية الموصوفة. نحدد طريقين محتملين لإدارة ANL في الفئران الحية عن طريق (1) مياه الشرب و (2) الحقن داخل الصفاق.
يتيح هذا البروتوكول تسمية البروتينات بطريقة محددة لنوع الخلية. هذه هي التقنية الأولى التي توفر مثل هذا الاحتمال ويمكن القيام به في المختبر أو في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البروتينات المحددة لنوع الخلية المسمى يمكن تنقيتها دون تحديد هويتها ، أو تصورها في الموقع بواسطة الفلورسنت المناعي.
للبدء في تحضير محللة الأنسجة عن طريق إضافة محلول تحلل بحجم 12 إلى 15 ضعف الوزن الرطب للأنسجة وسحن الأنسجة حتى يتم تجانسها. سخني هذا التجانس لمدة 15 دقيقة إلى 75 درجة مئوية لتفكيك البروتين ثم قم بطرد العينة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. يمكن تخزين هذه العينة عند 80 درجة سلزية تحت الصفر.
بعد ذلك ، بالنسبة للألكلة ، قم بتخفيف العينة المتجانسة مرتين إلى ثلاث مرات في محلول ملحي للفوسفات يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني الخالي من EDTA. ثم أضف اليودواسيتاميد الطازج إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمول. اترك العينة لمدة ساعة إلى ساعتين عند 20 درجة مئوية في الظلام.
كرر خطوات إضافة وحضانة اليودواسيتاميد مرتين. قم بإعداد العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة عن طريق تحريك الأعمدة أولا. ثم إزالة الغطاء وقطع الجزء السفلي والطرد المركزي لهم.
بعد ذلك ، قم بإجراء تبادل المخزن المؤقت عن طريق موازنة أعمدة تبادل المخزن المؤقت أولا باستخدام المخزن المؤقت لتبادل كيمياء النقر ثم تبادل جميع عينات الألكلة. لتقييم دمج azidonorleucine ، خذ 40 ميكرولترا من العينة المشار إليها وأضف محلول ملحي فوسفات إلى الحجم النهائي البالغ 120 ميكرولتر. ثم قم بإعداد تفاعل كيمياء النقر عن طريق تحريك التفاعل لمدة 20 ثانية.
بعد إضافة كل كاشف بالترتيب المشار إليه في أسرع وقت ممكن ، احتضان العينات في الظلام عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع الدوران المستمر. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة خمس دقائق عند 17،000 مرة G بعد الطرد المركزي ، ستظهر حبيبات فيروزية قليلا. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بتخزين العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
لتنقية البروتين المسمى. إخضاع جميع العينات لإجراء تبادل مؤقت كما هو موضح لتنظيف بقايا الألكاين الحرة باستخدام مخزن ربط النيوترافيدين كمخزن مؤقت للتوازن. ثم اغسل حبات النيوترافيدين عالية السعة ثلاث مرات عن طريق خلط الخرز مع المخزن المؤقت للربط.
الطرد المركزي الخليط ، وتجاهل الطافي وكرر هذا ثلاث مرات. ثم قم بإعداد ملاط واحد إلى واحد عن طريق إضافة نفس الحجم من حبات النيوترافيدين الجافة وعازلة ربط النيوترافيدين. ضع جانبا 20 إلى 40 ميكرولتر من كل عينة كمحلول منقى مسبقا وقم بتخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.
بعد قياس تركيز البروتين في العينة ، امزج مليغرام واحد من البروتين مع 40 ميكرولتر من ملاط الخرز. احتضان الخليط طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع الدوران المستمر لتمكين البروتينات الموسومة من الارتباط بالخرزات. في اليوم التالي جمع الطافت عن طريق الطرد المركزي.
ضع حصة 20 إلى 40 ميكرولتر من المادة الطافية جانبا لتحليلها لاحقا وقم بتجميد الباقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، اغسل الخرز ثلاث مرات عن طريق إضافة محلول غسيل نيوترافيدين مبرد. ترسيب الخرز والتخلص من المادة الطافية.
ثم أضف نفس المخزن المؤقت واحتضن الخرز لمدة 10 دقائق تحت دوران مستمر عند أربع درجات مئوية قبل التخلص من المادة الطافية. كرر الغسيل باستخدام مخازن غسيل النيوترافيدين الثانية والثالثة ، وقم بتخفيف البروتينات التي تم النقر عليها عن طريق احتضان الخرز لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع حجم عازلة شطف النيوترافيدين ، المقابلة لحجم واحد من الخرز الجاف المستخدم. أثناء الشطف ، حافظ على الخرزات معلقة عند 1000 دورة في الدقيقة في شاكر كتلة حرارية مراوغة مرتين وادمج كلا العود.
تم تحليل تفاعلات النقر بواسطة صفحة SDS واللطخة المناعية الغربية. يتم عرض صور تمثيلية للتجارب لإدارة أزيدونونورليوسين عن طريق الحقن داخل الصفاق ولإدارة أزيدونونورليوسين عن طريق مياه الشرب. تقدم تجربة أخرى مثالا لتحديد تركيز الألكاين القابل للانقسام لثاني كبريتيد البيوتين.
في هذا المثال، يكون التغير في الطي بين العينة المسماة والمجموعة الضابطة أعلى عند تركيز ألكاين 14 ميكرومولار. يظهر هنا مثال على نتيجة قياس الطيف الكتلي مع إثراء واضح في العينة الموسومة بالأزيدونونورليوسين مقارنة بالمجموعة الضابطة. كان هذا الاختلاف مرئيا بالفعل في وصمة البروتين الكلية.
إلى جانب التغيرات في شدة الببتيد ، توجد أيضا بروتينات فريدة في كلتا العينتين. هذا بروتوكول معقد تقنيا وهو خطوة يجب اتباعها بعناية باستخدام ألكلة الضوابط السلبية المناسبة ، والتنظيف المناسب (غير الواضح) والكافي للأرشيف بدون نقر. خطواتنا الرئيسية في هذا البروتوكول ، يمكن تحديد البروتينات النقية إما عن طريق قياس الطيف الكتلي إذا كان اهتمام الباحثين هو دراسة البروتينات أو تحميلها في هلام لدراسة البروتينات ذات الأهمية بواسطة اللطخة الغربية.
إن قدرة هذه الطريقة على تسمية البروتينات من أصل خلوي معين لها الكثير من التطبيقات مثل توتر البروتينات أو دراسة تخليق البروتين في المختبر أو في الجسم الحي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول نهجًا جديدًا لتسمية البروتينات المحددة لنمط الخلية باستخدام أزيدونورليوسين (ANL) مع نموذج فئران يعبر عن سينثازاز tRNA الميثيونين الطافر L274G (MetRS*). تمكن التقنية من تسمية وتنقية وتصور البروتينات في المختبر وفي الجسم الحي، مما يسهل دراسة تخليق البروتين والوظيفة الخلوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- كيمياء البروتين
الخلفية
- يسمح هذا البروتوكول بتسمية انتقائية للبروتينات المحددة لأنواع معينة من الخلايا.
- يتضمن البروتوكولات كلاً من التطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي.
- يمثل استخدام أزيدونورليوسين تقدمًا في تقنيات تسمية البروتين.
- يمكن استخدام المناعة الفلورية لتصور البروتينات المسمى.
هدف الدراسة
- لتأسيس طريقة لعزل البروتينات المحددة لنمط الخلية.
- لتوفير خطوات مفصلة لتسمية وتنقية البروتين.
- لتعزيز تحليل تخليق البروتين في سياقات خلوية مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تتضمن الدراسة نموذج فئران يعبر عن MetRS* لتسمية البروتين.
- تتضمن الخطوات المفصلة تحضير المستخلصات النسيجية، الألكيلة، وإجراءات التنقية باستخدام حبات النوترافيدين.
- يتم استخدام تفاعلات كيمياء النقر لتقييم دمج أزيدونورليوسين.
- يتم وصف البروتوكولات لكل من طرق إعطاء ANL عن طريق الماء والشرب وعبر التجويف البريتوني.
النتائج الرئيسية
- تم إثبات تسمية البروتين الناجحة من خلال تقنيات التنقية المختلفة.
- تمت ملاحظة تمييز واضح في العينات المسمى، مما يشير إلى دمج فعال لأزيدونورليوسين.
- تشمل النتائج الرئيسية تحديد البروتينات الفريدة التي قد تكون مرتبطة بالعمليات البيولوجية قيد الدراسة.
- يؤكد البروتوكول على الضوابط الصارمة والتنفيذ الدقيق لضمان الموثوقية.
الخلاصات
- توفر هذه الدراسة بروتوكولًا فريدًا ومعقدًا لدراسة البروتينات المحددة لنمط الخلية.
- توفر القدرة على تسمية البروتينات رؤى قيمة حول الآليات الخلوية وتخليق البروتين.
- قد تتقدم النتائج فهمنا للوظائف البيولوجية المختلفة ونماذج الأمراض.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific protein labeling and purification using the MetRS* mouse line enables precise interrogation of proteomic changes within complex tissues, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This approach reduces sample complexity, allowing for the identification of subtle proteomic shifts relevant to disease and therapeutic intervention. The method enhances predictive confidence at critical inflection points in the discovery pipeline by enabling direct measurement of newly synthesized proteins in defined cellular populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of protein synthesis dynamics in specific cell types within heterogeneous tissues.
- Supports functional target validation by isolating proteomic changes linked to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying cell-type contributions to disease-relevant pathways.
- Improves predictive confidence for target engagement and downstream biological effects.
Screening & Assay Development
- Provides validated, cell-type-specific proteomes for downstream assay development and screening workflows.
- Enables quantitative and reproducible measurement of newly synthesized proteins for assay standardization.
- Supports scalability and platform reuse by allowing both in vitro and in vivo applications.
- Improves reliability of compound evaluation by reducing background from non-target cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns proteomic outputs with disease-relevant cellular populations for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking protein synthesis in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing cell-type-resolved proteomic data.
- Enhances predictive de-risking for translational research by clarifying cellular mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for cell-type-specific proteomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective protein labeling in defined cell populations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative proteomic outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry and immunoblot readouts to compare proteomic profiles across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage findings to preclinical models by enabling in vivo protein synthesis tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for repeated use across diverse research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable proteomic workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cell-type-specific effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, mouse genetics, and click chemistry techniques.
- Demands access to mass spectrometry, immunoblotting, and specialized labeling reagents.
- Necessitates rigorous cross-team standardization and negative controls to ensure data reliability.
- May require adaptation for different tissue types or model systems based on cellular complexity.
- Technical complexity and need for careful execution are critical for reproducible results.
