تنقية البروتين المحدد من نوع الخلية والتعرف عليه من الأنسجة المعقدة باستخدام خط ماوس الميثيونين tRNA Synthetase الطافر

يتيح هذا البروتوكول تسمية البروتينات بطريقة محددة لنوع الخلية. هذه هي التقنية الأولى التي توفر مثل هذا الاحتمال ويمكن القيام به في المختبر أو في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البروتينات المحددة لنوع الخلية المسمى يمكن تنقيتها دون تحديد هويتها ، أو تصورها في الموقع بواسطة الفلورسنت المناعي.

للبدء في تحضير محللة الأنسجة عن طريق إضافة محلول تحلل بحجم 12 إلى 15 ضعف الوزن الرطب للأنسجة وسحن الأنسجة حتى يتم تجانسها. سخني هذا التجانس لمدة 15 دقيقة إلى 75 درجة مئوية لتفكيك البروتين ثم قم بطرد العينة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. يمكن تخزين هذه العينة عند 80 درجة سلزية تحت الصفر.

بعد ذلك ، بالنسبة للألكلة ، قم بتخفيف العينة المتجانسة مرتين إلى ثلاث مرات في محلول ملحي للفوسفات يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني الخالي من EDTA. ثم أضف اليودواسيتاميد الطازج إلى تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمول. اترك العينة لمدة ساعة إلى ساعتين عند 20 درجة مئوية في الظلام.

كرر خطوات إضافة وحضانة اليودواسيتاميد مرتين. قم بإعداد العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة عن طريق تحريك الأعمدة أولا. ثم إزالة الغطاء وقطع الجزء السفلي والطرد المركزي لهم.

بعد ذلك ، قم بإجراء تبادل المخزن المؤقت عن طريق موازنة أعمدة تبادل المخزن المؤقت أولا باستخدام المخزن المؤقت لتبادل كيمياء النقر ثم تبادل جميع عينات الألكلة. لتقييم دمج azidonorleucine ، خذ 40 ميكرولترا من العينة المشار إليها وأضف محلول ملحي فوسفات إلى الحجم النهائي البالغ 120 ميكرولتر. ثم قم بإعداد تفاعل كيمياء النقر عن طريق تحريك التفاعل لمدة 20 ثانية.

بعد إضافة كل كاشف بالترتيب المشار إليه في أسرع وقت ممكن ، احتضان العينات في الظلام عند أربع درجات مئوية طوال الليل مع الدوران المستمر. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينات لمدة خمس دقائق عند 17،000 مرة G بعد الطرد المركزي ، ستظهر حبيبات فيروزية قليلا. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بتخزين العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لتنقية البروتين المسمى. إخضاع جميع العينات لإجراء تبادل مؤقت كما هو موضح لتنظيف بقايا الألكاين الحرة باستخدام مخزن ربط النيوترافيدين كمخزن مؤقت للتوازن. ثم اغسل حبات النيوترافيدين عالية السعة ثلاث مرات عن طريق خلط الخرز مع المخزن المؤقت للربط.

الطرد المركزي الخليط ، وتجاهل الطافي وكرر هذا ثلاث مرات. ثم قم بإعداد ملاط واحد إلى واحد عن طريق إضافة نفس الحجم من حبات النيوترافيدين الجافة وعازلة ربط النيوترافيدين. ضع جانبا 20 إلى 40 ميكرولتر من كل عينة كمحلول منقى مسبقا وقم بتخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد قياس تركيز البروتين في العينة ، امزج مليغرام واحد من البروتين مع 40 ميكرولتر من ملاط الخرز. احتضان الخليط طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع الدوران المستمر لتمكين البروتينات الموسومة من الارتباط بالخرزات. في اليوم التالي جمع الطافت عن طريق الطرد المركزي.

ضع حصة 20 إلى 40 ميكرولتر من المادة الطافية جانبا لتحليلها لاحقا وقم بتجميد الباقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، اغسل الخرز ثلاث مرات عن طريق إضافة محلول غسيل نيوترافيدين مبرد. ترسيب الخرز والتخلص من المادة الطافية.

ثم أضف نفس المخزن المؤقت واحتضن الخرز لمدة 10 دقائق تحت دوران مستمر عند أربع درجات مئوية قبل التخلص من المادة الطافية. كرر الغسيل باستخدام مخازن غسيل النيوترافيدين الثانية والثالثة ، وقم بتخفيف البروتينات التي تم النقر عليها عن طريق احتضان الخرز لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع حجم عازلة شطف النيوترافيدين ، المقابلة لحجم واحد من الخرز الجاف المستخدم. أثناء الشطف ، حافظ على الخرزات معلقة عند 1000 دورة في الدقيقة في شاكر كتلة حرارية مراوغة مرتين وادمج كلا العود.

تم تحليل تفاعلات النقر بواسطة صفحة SDS واللطخة المناعية الغربية. يتم عرض صور تمثيلية للتجارب لإدارة أزيدونونورليوسين عن طريق الحقن داخل الصفاق ولإدارة أزيدونونورليوسين عن طريق مياه الشرب. تقدم تجربة أخرى مثالا لتحديد تركيز الألكاين القابل للانقسام لثاني كبريتيد البيوتين.

في هذا المثال، يكون التغير في الطي بين العينة المسماة والمجموعة الضابطة أعلى عند تركيز ألكاين 14 ميكرومولار. يظهر هنا مثال على نتيجة قياس الطيف الكتلي مع إثراء واضح في العينة الموسومة بالأزيدونونورليوسين مقارنة بالمجموعة الضابطة. كان هذا الاختلاف مرئيا بالفعل في وصمة البروتين الكلية.

إلى جانب التغيرات في شدة الببتيد ، توجد أيضا بروتينات فريدة في كلتا العينتين. هذا بروتوكول معقد تقنيا وهو خطوة يجب اتباعها بعناية باستخدام ألكلة الضوابط السلبية المناسبة ، والتنظيف المناسب (غير الواضح) والكافي للأرشيف بدون نقر. خطواتنا الرئيسية في هذا البروتوكول ، يمكن تحديد البروتينات النقية إما عن طريق قياس الطيف الكتلي إذا كان اهتمام الباحثين هو دراسة البروتينات أو تحميلها في هلام لدراسة البروتينات ذات الأهمية بواسطة اللطخة الغربية.

إن قدرة هذه الطريقة على تسمية البروتينات من أصل خلوي معين لها الكثير من التطبيقات مثل توتر البروتينات أو دراسة تخليق البروتين في المختبر أو في الجسم الحي.