انعكاس التداخل المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصوير الأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بها
May 3rd, 2022
نقدم بروتوكولا لتنفيذ الفحص المجهري لانعكاس التداخل والمجهر الفلوري الداخلي الكلي للتصوير المتزامن للأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة ذات العلامات الفلورية.
تكمن أهمية هذه الطريقة في أنها تسمح بالأنابيب الدقيقة الخالية من الملصقات إلى الصورة في وقت واحد مع البروتينات ذات العلامات الفلورية بمعدلات إطارات عالية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي سهولة تنفيذها والحد الأدنى من الطلبات على المكونات البصرية. كما أنه يتحايل على الحاجة إلى وضع العلامات على الفلورو-4 للأنابيب الدقيقة.
للبدء ، قم بإعداد بوليمر PDMS من خلال الجمع بين عامل المعالجة والمطاط الصناعي الأساسي بنسبة كتلة 1: 10. اخلطيها لمدة دقيقتين ثم قم بفك الخليط في غرفة فراغ حتى تختفي جميع الفقاعات. بعد ذلك ، صب الخليط على القالب الرئيسي في طبقة بسمك 0.5 سم تقريبا ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات ، واخبز الخليط في فرن مسخن مسبقا عند 70 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
ثم ، قم بقطع المناطق الهيكلية للبوليمر وثقوب الثقب في كل طرف من أطراف القناة باستخدام مثقاب PDMS. في وقت لاحق ، قم بتنظيف الجانب المنظم من كتلة PDMS. بعد ذلك ، شطف ثلاث مرات مع الأيزوبروبانول والميثانول تليها المياه فائقة النقاء وتجفيف السطح.
بعد ذلك ، تقوم البلازما بتنظيف PDMS باستخدام الأكسجين أو بلازما الهواء ووضع PDMS الذي تم تنظيفه بواسطة البلازما على زجاج غطاء تم تنظيفه بشكل مناسب. سخني صفيحة ساخنة على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أدخل أنابيب البولي إيثيلين منخفضة الكثافة ذات الحجم المناسب في الثقوب وقم بتوصيل أنبوب المخرج بحقنة سعة 0.5 ملليلتر.
ثم ، قم بتدفق المحاليل إلى القنوات الدقيقة عن طريق غمر أنبوب المدخل في المحلول ورسم الحجم المطلوب باستخدام المحقنة. ضع العينة على مرحلة المجهر وقم بتشغيل مصدر ضوء الإضاءة epi-litation لتصوير IRM. لتركيز المجهر، ابحث عن المستوى البؤري الصحيح بالقرب من واجهة حل PDMS واختر مجال رؤية بالقرب من مركز القناة.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول 0.1-micromolar من الميكروبيدات الفلورية في BRB80 والتدفق في حجم قناة واحدة على الأقل من محلول الميكروبيد. راقب التفاعل عبر IRM أو TIRF. عندما يتم تحقيق الكثافة المطلوبة من الميكروبيدات ، اغسل الفائض باستخدام BRB80.
تدفق البذور المخففة إلى غرفة التفاعل ومراقبة التفاعل من خلال IRM. عندما يتم تحقيق الكثافة المطلوبة من البذور ، اغسل الفائض باستخدام BRB80. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط تمديد microtubule يحتوي على 12-micromolar tubulin غير المسمى ، GTP واحد ملليمولار ، DTT خمسة ملليمولار في المخزن المؤقت BRB80.
ثم ، تدفق في حجم قناة واحدة على الأقل من خليط التمديد مع ضمان أن درجة حرارة التفاعل هي 28 درجة مئوية. للبدء، قم بتعيين إعدادات التصوير على برنامج المجهر. بدء التصوير وتدفق محلول كينيسين إلى الغرفة.
ثم ، تصور GFP المسمى kinesin 1 الأنابيب الدقيقة غير المتقلصة. بعد اكتمال القياس ، سجل مقطع فيديو قصيرا يتم فيه ترجمة المرحلة ببطء في حركة دائرية أو جانبية. سيكون متوسط الإسقاط لهذا الفيديو بمثابة صورة خلفية وسيتم طرحه من القياسات الأولية.
قم بإنشاء إسقاط متوسط في ImageJ من تسجيل الخلفية بالنقر فوق صورة. ثم حدد الخيار مكدسات وانقر على Z Project. بعد ذلك ، اطرح متوسط إسقاط الخلفية من بيانات الصورة الخام بالنقر فوق عملية ثم حدد الخيار حاسبة الصور مع التأكد من التحقق من خيار نتيجة التعويم 32 بت.
لتسجيل الصور ، اختر مجموعة من الميكروبيدات بالقرب من الأنابيب الدقيقة ذات الأهمية واستخدمها لمحاذاة صور TIRF و IRM. لكل حبة في هذه المجموعة، استخدم أداة التحديد متعدد النقاط لتحديد الموقع التقريبي في قناة TIRF ثم الموقع المقابل في قناة IRM. ثم قم بتشغيل الماكرو ImageJ المتوفر.
تظهر الميكروبيدات كبقع داكنة في قناة IRM على اليمين وكنقاط مضيئة في قناة TIRF على اليسار. يقوم إجراء المحاذاة بتراكب القناتين بشكل صحيح عن طريق توطين مجموعة مختارة من الخرز. كما تم الحصول على كيموجغراف لجزيئات كينيسين المسماة EGFP التي تسير نحو الأطراف المتقلصة للأنابيب الدقيقة باستخدام هذا البروتوكول.
عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم اختيار أهداف فتحة العددية العالية من أجل تحقيق انعكاس داخلي كامل وأيضا لزيادة كفاءة المجموعة وتباين الصورة إلى أقصى حد. يمكن استخدام هذه الطريقة للتصوير عالي الدقة لجزيئات الفلورسنت المفردة في وقت واحد داخل البنية الجزيئية الكبيرة الضخمة بما يكفي لتصورها بواسطة IRM ، مثل غشاء الخلية أو خيوط الأكتين. يوفر هذا البروتوكول أيضا إجراء قابلا للتكيف بسهولة للتصوير المتزامن مع أي مزيج من IRM و TIRF و epifluorescence.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتنفيذ الميكروسكوب الضوئي للانعكاس-التداخل (IRM) والميكروسكوب الضوئي للانعكاس الداخلي الكلي الفلوري (TIRF) لتصوير الأنيبيبات الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة الموسومة بالفلورسنت بشكل متزامن. تتيح هذه الطريقة تصويرًا عالي الدقة للإطار لتصوير الأنيبيبات الدقيقة الخالية من الملصقات جنبًا إلى جنب مع البروتينات الفلورينية، مما يعزز دراسة الديناميات الخلوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات الميكروسكوب
الخلفية
- IRM وTIRF هما تقنيات تصوير متقدمة تستخدم لتصور المكونات الخلوية.
- تلعب الأنابيب الدقيقة دورًا حاسمًا في بنية الخلية ووظيفتها.
- يستخدم الوسوم الفلورينية عادةً لدراسة البروتينات، ولكن يمكن أن يعقد تصوير الأنابيب الدقيقة.
- يهدف هذا البروتوكول إلى تبسيط عملية التصوير مع الحفاظ على الدقة العالية.
غرض الدراسة
- توفير طريقة موثوقة لتصوير متزامن للأنيبيبات الدقيقة والبروتينات المرتبطة بها.
- لتوضيح مزايا استخدام IRM وTIRF للدراسات الديناميكية.
- تسهيل التصوير عالي الدقة دون الحاجة إلى تقنيات تسمية معقدة.
الطرق المستخدمة
- إعداد بوليمر PDMS لتصنيع القنوات الميكروية.
- تدفق المحاليل في القنوات الميكروية للتصوير.
- ضبط معلمات التصوير على الميكروسكوب للحصول على نتائج مثالية.
- استخدام ImageJ لمعالجة الصور ومحاذاة صور TIRF وIRM.
النتائج الرئيسية
- تصوير متزامن ناجح للأنيبيبات الدقيقة والبروتينات الموسومة بالفلورسنت.
- تصور عالي الدقة لجزيئات الكينيسين التفاعلية مع الأنابيب الدقيقة.
- مواءمة فعالة لصور TIRF وIRM باستخدام الكريات الدقيقة.
- تبيان قابلية البروتوكول للتكيف لمختلف تركيبات التصوير.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول نهجًا مباشرًا لدراسة ديناميات الأنيبيبات الدقيقة.
- يمكن الجمع بين IRM وTIRF بشكل فعال لتعزيز قدرات التصوير.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنظمة بيولوجية مختلفة لتحليل مفصل.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Simultaneous IRM and TIRF microscopy enables high-speed, dual-channel imaging of dynamic microtubules and associated proteins without the need for extensive labeling or complex optical setups. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing quantitative, label-free visualization alongside single-molecule fluorescence detection. The approach streamlines imaging workflows, reduces photobleaching risk, and enhances predictive confidence in cytoskeletal protein studies relevant to biopharma discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein-microtubule interactions for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing dynamic cytoskeletal processes in real time.
- Facilitates hypothesis testing on protein localization and motility without labeling artifacts.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible imaging platform for quantitative analysis of protein dynamics.
- Reduces assay complexity by eliminating the need for dual labeling and additional excitation sources.
- Enables high-throughput screening readiness by imaging both channels on a single camera chip.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by supporting studies of cytoskeletal dynamics implicated in neurodegeneration and oncology.
- Maintains translational continuity by enabling single-molecule resolution in physiologically relevant environments.
- Improves risk-adjusted advancement decisions through robust, quantitative imaging outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-mode imaging method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of microtubule-associated protein function and pathway mapping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and phenotypic screening.
- Analytics: Provides high-resolution, synchronized readouts for direct comparison of protein and filament dynamics.
- Translational Research: Enables continuity from in vitro mechanistic studies to disease-relevant model systems.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible imaging platform adaptable to various cytoskeletal and membrane-associated targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Simplifies imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cytoskeletal targets and associated pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and image analysis software such as ImageJ.
- Needs access to high numerical aperture objectives and compatible TIRF/IRM-capable microscopes.
- Demands cross-team standardization for image registration and background correction procedures.
- Adaptable to various model systems, including actin filaments and cell membranes, with minimal protocol changes.
- Practical limitations include the need for careful alignment and potential throughput constraints for large-scale screens.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:29
Preparation of PDMS Channels
2:15
Preparation for Imaging
3:02
Growing Dynamic Guanosine Diphosphate “Extensions”
3:46
Kinesin Motility Assay
4:23
Image Processing and Analysis
5:22
Results: Imaging of Dynamic Microtubules and Fluorescently Labeled Microtubule-Associated Proteins
5:57
Conclusion
