المجهر الإلكتروني للانتقال في الموقع الناجم عن الضوء لمراقبة تفاعل المادة السائلة اللينة

يقدم البروتوكول كيف يمكن استخدام مزيج من TEM للخلايا السائلة وإضاءة الضوء لمراقبة التغيرات الهيكلية في البكتيريا المغلفة بمحسس ضوئي عند إضاءة الضوء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها. لا يتطلب البروتوكول إعدادا صعبا للعينات ويوفر تغليفا كافيا للبكتيريا بمحلول محسس للضوء.

للبدء ، قم بتعديل المجهر الإلكتروني الناقل عن طريق توصيل الألياف البصرية بعمود المجهر في الجزء العلوي من العدسة الموضوعية. اترك بضعة سنتيمترات من المساحة بين العدسة الموضوعية والعدسة المكثفة، بالإضافة إلى فتحة مجانية للملحقات. ضع شبكتين TEM غير معالجتين مغطاة بالكربون غير المتبلور بين ملاقط متقاطعة ، تواجه الجانب المطلي بالكربون إلى الأعلى.

أمسك الشبكات بالقرب من الحافة قدر الإمكان. ضع أربعة ميكرولترات من محلول البكتيريا على إحدى الشبكات. يجب أن تكون الكثافة البصرية للعينة في حدود خمسة إلى 10.

انتظر لمدة 60 ثانية ، وقم بمسح السائل بعناية باستخدام ورق التصفية. حاول نشر السائل في جميع أنحاء سطح الشبكة بالكامل أثناء العملية. ضع أربعة ميكرولترات من المحسس الضوئي على نفس الشبكة.

بعد خمس ثوان ، قم بمسح السائل. اترك طبقة رقيقة جدا من السائل على الركيزة. ضع الشبكة الجافة بسرعة فوق الشبكة المغطاة بالسائل.

حرك الشبكة العلوية برفق إلى حافة الشبكة الثانية ، واضغط على الركائز عند الحواف باستخدام ملاقط. كرر الضغط بعناية. اترك الخلية السائلة بين الملقط لمدة دقيقة واحدة.

أدخل العينة في حامل TEM مباشرة بعد الانتهاء من التحضير. بعد إدخال العينة في المجهر ، ابدأ الملاحظات في وضع التكبير المنخفض للعثور على منطقة مراقبة مناسبة. أثناء الملاحظات ، حافظ على جرعة الإلكترون منخفضة قدر الإمكان.

قم بتوسيع وقت التعرض. ابحث عن الخلايا المحاطة بالسائل عند التكبير المناسب مع وقت التعرض الممتد ، والتقط الصورة الأولى على الفور. حافظ على ثبات جرعة الإلكترون ، وجمع الصور كل 30 ثانية لمراقبة التغييرات.

فحص الصور بعناية وحساب إجمالي جرعة الإلكترون التي تتوافق مع التغيرات المرئية الأولى في الخلايا. قبل البدء في التجربة، اضبط شدة ضوء الليزر عن طريق ضبط القيمة الحالية. أدخل العينة في المجهر وابحث عن منطقة المراقبة.

التقط الصورة الأولى للخلية قبل بدء إضاءة العينة، واستخدم فراغ الشعاع لإيقاف تشغيل شعاع الإلكترون لتجنب تأثيرات تشعيع الإلكترون. قم بتشغيل الليزر. ابدأ بوقت إضاءة قصير ، حيث أن ضوء الليزر له كثافة عالية نسبيا.

بعد ذلك الوقت ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء. قم بإيقاف تشغيل فراغ الشعاع ، والتقط الصورة على الفور. إذا كان ذلك ممكنا، استخدم خوارزمية تلقائية لعرض العينة فقط للوقت اللازم لالتقاط الصورة.

قم بقياس وقت تشعيع الإلكترون بعناية لحساب جرعة الإلكترون المستخدمة في التصوير. لوحظ تدهور ملحوظ في الطبقة الخارجية للخلية ناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن الإشعاع الأخف من المحسس الضوئي بعد دقيقة واحدة. جعلت الإضاءة الضوئية الإضافية التغييرات أكثر وضوحا.

يمكن العثور بسهولة على بقع المراقبة المناسبة التي تحتوي على ما يكفي من السائل عند التكبير المنخفض ، حيث تبدو هذه المناطق أكثر قتامة وغير واضحة. البكتيريا المغطاة بالسائل أقل وضوحا من البكتيريا الجافة ، ولكن لا يزال من الممكن تمييزها. من المفيد النظر إلى الحدود السائلة أثناء التصوير ، ويمكن اكتشاف حركتها بسهولة ، مما يعني أن المنطقة المختارة قد تكون غير مناسبة وغير مستقرة.

هناك مشكلة أخرى أثناء الملاحظات وهي تبخر الماء وهطول الأمطار من المحلول الذي يمكن أن يحدث في مناطق عشوائية من العينة ، بما في ذلك المناطق المحيطة بالبكتيريا. يمكن أيضا إجراء تغليف البكتيريا باستخدام أغشية نترات الجرافين والسيليكون. إعداد العينة أكثر صعوبة ، ولكن استقرار الخلية السائلة سيكون أفضل.

يمكن استخدام الطريقة المقدمة لرصد التفاعلات التي يسببها الضوء على السائل. على سبيل المثال ، تأثير الضوء على المواد المعدنية والمحفزات التي يسببها الضوء والتفاعلات الكيميائية الضوئية.