الحفاظ على التنوع الخلوي للورم الأرومي الدبقي البشري خارج الجسم الحي باستخدام ثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد

يعد العثور على علاجات للورم الأرومي الدبقي أمرا صعبا بسبب التنوع الخلوي الموجود في الأورام والتفاعلات بين البيئات الدقيقة المتنوعة. يمكن أن تساعد المواد العضوية في إعادة إنشاء بعض هذا التنوع المكاني ، ويمكننا استخدام هذا لفهم بيولوجيا الأورام بشكل أفضل. في حين أن طرق زراعة الخلايا التقليدية تميل إلى إنتاج مجموعات متجانسة من الخلايا السرطانية ، يمكن للعضويات أن تحاكي بشكل أفضل التنوع الجزيئي والخلوي للورم الأرومي الدبقي ونموذج أفضل للتفاعلات داخل الفخذ.

يمكن استخدام المواد العضوية للتحقيق في فعالية الدواء وآليات المقاومة. قد تظهر مقاومة العلاجات السريرية فقط في المواد العضوية وليس في ثقافة المجال التقليدية ، مما يعكس الواقع السريري لهذا المرض. يمكن أن تساعد المواد العضوية في إظهار الآثار الإقليمية للعلاجات الكيميائية.

يمكن استخدامها لاكتشاف علاجات جديدة متخصصة ، ويمكن أن تعمل أيضا كأداة تنبؤية للطب الشخصي في المستقبل. بعض المواد المستخدمة لإنشاء المواد العضوية حساسة لدرجة الحرارة ، وإهمال الحفاظ على هذه المواد في درجة حرارتها المناسبة يمكن أن يؤدي إلى صعوبات في إنشاء أو الحفاظ على المواد العضوية. ابدأ في تحضير القوالب العضوية تحت غطاء محرك السيارة عن طريق إزالة ورقة الشمع من ورقة البارافيلم ووضعها بين اثنين من تفاعل البوليميراز المتسلسل المعقم 96 بئرا أو ألواح PCR.

تأكد من أن الجزء الداخلي من البارافيلم نظيف. ضع ضغطا متساويا على اللوحة العلوية لتشكيل دمامل صغيرة بعمق مليمترين في البارافيلم دون إنشاء ثقوب. افصل اللوحات.

سوف يلتصق البارافيلم المدمل باللوحة العلوية. ثم ضع الطبق العلوي على الثلج الجاف لمدة 30 ثانية. استخدم ملقط معقم لسحب البارافيلم من اللوحة العلوية بحركة سريعة.

البارافيلم المجمد أسهل في الإزالة. ضع قالب البارافيلم المكتمل في طبق زراعة خلايا مغطى ومعقم بطول 10 سم. لإعداد تعليق أحادي الخلية من الورم الأرومي الدبقي أو ثقافة الالتصاق GBM ، قم بإزالة الوسائط المستخدمة من اللوحة.

ثم أضف ملليلترين من محلول انفصال الخلايا في درجة حرارة الغرفة إلى اللوحة ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة لمدة ثلاث دقائق. بعد التأكد من انفصال الخلية عن الصفيحة تحت المجهر ، أضف ثمانية ملليلترات من Neurobasal Medium complete ، أو NBMc medium ، لتحييد محلول انفصال الخلية. قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية واحدة سعة 70 ميكرون.

قم بتدوير الخلايا بسرعة 120 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من NBMc. عد الخلايا من تعليق خلية واحدة باستخدام بقعة خلية غير مقصودة.

لصنع المواد العضوية من نظام تعليق أحادي الخلية، أضف كمية مناسبة من المصفوفة خارج الخلية الغنية باللامينين، أو lrECM، إلى أنبوب طرد مركزي صغير في دلو ثلج أو كتلة باردة. تحضير خليط الخلايا التي تحتوي على 20،000 خلية لكل عضوي. امزج خليط تعليق الخلايا lrECM جيدا لتجنب ترسب الخلايا ، مما يؤدي إلى تكوين عضوي غير منتظم.

بعد ذلك ، قم بماصة 20 ميكرولتر من الخليط بعناية على قالب بارافيلم لتشكيل قطرة تشبه اللؤلؤ. تأكد من تبريد طرف الماصة كل اثنين إلى ثلاثة عضويات لمنع بلمرة lrECM. بمجرد أن يتم ماصة العدد المطلوب من المواد العضوية على قالب البارافيلم في صفيحة استزراع طولها 10 سنتيمترات ، احتضن المواد العضوية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين في حاضنة زراعة الخلايا.

بعد تصلب المواد العضوية ، اطرد المواد العضوية بلطف من قالب البارافيلم باستخدام وسيط NBMc باستخدام طرف P1000 وجمعها في صفيحة استزراع جديدة بطول 10 سنتيمترات تحتوي على 20 ملليلتر من NBMc. ضع لوحة الثقافة في حاضنة دون أن تهتز لمدة أربعة أيام. بعد أربعة أيام ، استبدل الوسائط الموجودة في اللوحة.

للقيام بذلك ، ضع قطعة من الورق الداكن أسفل لوحة زراعة الخلايا. قم بإمالة اللوحة وانتظر لمدة 20 ثانية. عندما تستقر المواد العضوية تماما في الجزء السفلي من الطبق ، قم بإزالة الوسائط ببطء باستخدام ماصة زجاجية كبيرة الفتح.

بعد إضافة وسائط جديدة ، ضع اللوحة في الحاضنة على شاكر مداري عند 80 دورة في الدقيقة ، وتبادل الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام بعد ذلك. لوحظ نمو العضوية باستخدام المجهر الضوئي. في وجهة نظر المركز ، أظهر النمو العضوي المبكر الهجرة وغزو الخلية الواحدة من خلال lrECM.

كانت المواد العضوية الناضجة في سبعة أسابيع بالنسبة لحجم عشرة سنتات. كشف التلطيخ الكيميائي المناعي للعضويات GBM مع فوسفو هيستون H3 عن خلايا تكاثرية عالية مع مظهر بني أو أرجواني في محيط العضوية مقارنة بالنواة. أظهرت بيانات صلاحية الخلية للعضويات في 0.1٪ DMSO الاتساق داخل العضوية وبين العضويات.

انتبه إلى الكتلة الحيوية العضوية وتحمض الوسائط. إذا كانت المواد العضوية تمر عبر الوسائط بسرعة كبيرة ، فتأكد من تبادل الوسائط بشكل متكرر أو تقسيم المواد العضوية بين لوحات إضافية. يمكن استخدام المواد العضوية الناضجة للتجارب مع العلاجات أو تضمينها وتقسيمها للاستخدام مع الكيمياء النسيجية المناعية أو التألق المناعي.

يمكن استخدام المواد العضوية المنفصلة لتحليل FACS. تم استخدام هذه المواد العضوية مؤخرا في الفحص الوظيفي ثلاثي الأبعاد لاكتشاف الأهداف الأساسية في منافذ الخلايا الجذعية السرطانية المتميزة مكانيا. نحن نستخدم أيضا هذه النماذج لتحديد أولويات الأدوية والعلاجات المختلفة قبل الاختبار في الجسم الحي.