إعداد وتحليل مورفولوجي لمزارع خلايا القمة العصبية القحفية للكتكوت

تهاجر خلايا القمة العصبية من الطيات العصبية القحفية في الأجنة أو عند وضعها في الثقافة. وهذا يوفر طريقة ملائمة لعزل خلايا القمة العصبية المهاجرة الأولية دون تفكك الخلايا. في حين أن هجرة القمة العصبية تحدث عادة داخل البيئة الجنينية ثلاثية الأبعاد ، فإن الثقافة ثنائية الأبعاد تمكن من تصور والتحقيق في العمليات المتعلقة بالهجرة.

على الرغم من وجود بروتوكولات زراعة الطيات العصبية القحفية ، إلا أن هذه الطريقة تتطلب التدريب والخطوات الخاصة بالكائن الحي. يوضح هذا الفيديو تقنيات لتسهيل التحضير القابل للتكرار لمزارع الطيات العصبية في الجمجمة الكتكانية. غالبا ما يكافح المبتدئون مع تشريح وطلاء الطيات العصبية وتقييم نتائج الثقافة.

يسمح اتباع إرشادات التشريح وتطبيق التحليل المورفومتري الموصوف هنا بالحصول على نتائج كمية متسقة. للبدء ، ضع البيض المخصب في وضع مستقيم داخل حاضنة رطبة عند 38 درجة مئوية. بعد إزالة البيض من الحاضنة ، قم بتطهير الأصداف عن طريق رش 70٪ من الإيثانول جيدا وتركها تجف.

لإصلاح الثقافات وتلوينها ، استخدم زلات الغطاء الزجاجي الموضوعة في طبق زراعة الأنسجة متعدد الآبار ، وماصة ما يكفي من محلول الفيبرونيكتين لتغطية قاع البئر. بعد ذلك ، استبدل الغطاء ، واحتضن اللوحة بمحلول فيبرونيكتين في حاضنة رطبة عند 38 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل أثناء تشريح الطيات العصبية. استخدم ملقط حاد لكزة ثقب صغير في القشرة عند 1/4 إلى 1/3 من طول البيضة.

أدخل الملقط الحاد بعناية في الحفرة الصغيرة ، مما يضمن عدم تعطيل صفار البيض. ثم ، قطع قشر البيض حول البيضة ، وإزالة الجزء العلوي من قشر البيض ، ووضع الجنين للعزل. قم بتحضير الجنين باستخدام الحافة المسطحة للملقط الحاد المغلق بلطف لمسح أي ألبومين زائد على سطح صفار البيض الذي يغطي الجنين.

استخدم الملقط لوضع إطار دعم ورقة الترشيح فوق الجنين، مع وجود الجنين في نافذة الإطار. اضغط برفق لأسفل على ورقة الترشيح للالتصاق بصفار البيض. قطع حول الجزء الخارجي من إطار ورقة الترشيح مع مقص تشريح.

استخدم الملقط أو أطراف المقص للإمساك بحافة الإطار، وارفع الجنين برفق بعيدا عن صفار البيض. ضع الجنين مع الإطار الورقي جانبا لأسفل في طبق بتري سعة 60 أو 100 ملليلتر مملوء ب Ringer's مع بكتيريا القلم. احتفظ بطبق الأجنة على الجليد إذا قمت بجمعها من أجل تطبيق الحمض النووي الريبي أو المصب الحساس للبروتين.

انقل جنينا إلى طبق نظيف يحتوي على محلول القلم العقدي من رينجر. حرك الجنين بلطف ذهابا وإيابا لإزالة أي صفار يحجب الرؤية ، واستبدل محلول القلم العقدي في Ringer أو انقله إلى طبق طازج إذا أصبح غائما. ضع الجنين ظهريا وإطار جانبي تحت مجهر تشريح.

اتركي الجنين على الإطار الورقي لإبقائه ممتدا ومثبتا في مكانه. ثم ، قم بإزالة غشاء vitelline ، باستخدام ملقط لفضح الطيات العصبية. قم بتضمين الأنسجة الذيلية إلى الحويصلات البصرية المتوسعة والسطح إلى الدماغ الخلفي ، حيث بدأت انقباضات المعينات في الظهور للتو.

باستخدام مقص الربيع ، قم باستئصال الطيات العصبية في الدماغ المتوسط بعناية. احرص على استئصال الجانب الظهري من الطية العصبية مع الحد الأدنى من تلوث الأنبوب العصبي والأديم الخارجي غير العصبي ، ونقل الطيات العصبية إلى طبق نظيف يحتوي على محلول Ringer's pen-strep باستخدام ماصة P20 أو ماصة Pasteur الزجاجية المعقمة التي يتم شطفها بمحلول Ringer's Pen-strep الخاص ب Yolky. تخزين الطيات المجمعة على الجليد أثناء تشريح طيات إضافية.

بعد إزالة طبق الثقافة من الحاضنة ، استخدم ماصة أو ماصة باستور لإزالة محلول الفيبرونيكتين من زلات الغطاء أو الطبق أو البئر. بعد شطف الركيزة المغلفة بالفيبرونيكتين بمحلول Ringer's pen-strep ، أضف حجما مناسبا من وسائط الثقافة الكاملة إلى الطبق أو جيدا. لمنع البلاستيك ومنع الأنسجة من الالتصاق ، استخدم ماصة P20 أو P200 ، واشطف طرف الماصة بمحلول القلم العقدي من Ringer.

بعد ذلك ، انقل الطيات العصبية المعزولة نحو وسط زلة الغطاء المطلية بالفيبرونيكتين ، مع الحرص على نقل أقل قدر ممكن من محلول القلم العقدي من Ringer. بعد السماح للنباتات بالاستقرار لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، ضعها في غرفة رطبة عند 38 درجة مئوية عن طريق حمل طبق الثقافة ببطء وبعناية مع طيات عصبية مطلية. قم بإزالة وسائط الاستزراع باستخدام ماصة باستور ، وشطف الآبار باستخدام PBS المعقم بالفلتر.

أضف 4٪ بارافورمالديهايد ، واحتفظ به على شاكر المنصة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة بارافورمالدهيد ، وشطف الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS ، وإضافة PBST التي تحتوي على مصل 5٪. الآن ، ماصة 30 ميكرولتر من 200-nanomolar أوريغون الأخضر المترافقة phalloidin على سطح أملس لكل زلة غطاء.

باستخدام زوج من الملقط ، قم بإزالة زلة الغطاء من PBST التي تحتوي على مصل 5٪ ، مما يضمن اتجاه الخلايا المتجهة لأعلى. تخلص من السائل الزائد عن طريق لمس حافة الغطاء لفترة وجيزة إلى ممسحة مهام حساسة. ضع بلطف كل خلية انزلاق الغطاء جانبا على قطرة من الفلويدين المخفف ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد فترة الحضانة ، ارفع الغطاء من محلول التلطيخ وضعه مرة أخرى في طبق الثقافة ، وقلبه حتى يكون جانب الخلية لأعلى. تأكد من تغطية الغطاء ب PBST ، وضعه على شاكر المنصة لمدة 10 دقائق ، مع الحفاظ على قسائم الغطاء مغطاة وفي الظلام. قم بإزالة PBST ، وكرر غسل الغطاء مرتين لما مجموعه ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق.

ضع قطرة واحدة من وسائط التركيب على شريحة المجهر. قم بتركيب خلية انزلاق الغطاء جانبا لأسفل عن طريق خفض انزلاق الغطاء ببطء بزاوية على وسائط التركيب لتجنب إنشاء فقاعات، والسماح للوسائط بضبط نفسها قبل التصوير. أخيرا ، قم بتصوير الخلايا الملطخة ، وقم بتصديرها كملفات TIFF.

بدأت خلايا القمة العصبية في الظهور من الطية العصبية الملتصقة في غضون ثلاث إلى أربع ساعات من الحضانة ، وتم الانتهاء من الهجرة بعد حوالي 20 ساعة. تم تصنيف خلايا القمة العصبية المهاجرة باستخدام HNK-1 ، ويبدو أن معظم الخلايا إيجابية HNK-1. تم تصور خلايا القمة العصبية المهاجرة عن طريق تلطيخ الأكتين الخيطي مع الفيلويدين.

تمت معالجة صور الخلايا الملطخة بالفيلويدين باستخدام ImageJ لإنتاج صورة عتبة تظهر فيها الخلايا سوداء مع خلفية بيضاء. تم تحليل صورة العتبة وعرض قياسات مختلفة في الرسوم البيانية الشريطية المتناقضة أو قطع الكمان. على سبيل المثال ، كان متوسط مساحة الخلايا ال 69 التي تم تحليلها حوالي 802.11 ميكرومتر مربع ، يتراوح من 60.27 إلى 2،664.53 ميكرومتر مربع.

يعكس الدائري بروز الخلية ويتراوح من 0.101 إلى 0.875. تشير القيم السفلية إلى شكل ممدود ، بينما تشير قيمة واحد إلى دائرة مثالية. أظهرت معظم الخلايا شكلا ممدودا ، والذي يمكن رؤيته بسهولة في مؤامرة الكمان.

كان متوسط نسبة العرض إلى الارتفاع لخلايا القمة العصبية المهاجرة في هذا المجال حوالي 2.13 ، وتشير نسبة العرض إلى الارتفاع لواحد إلى شكل متماثل. يعد الاستئصال الدقيق والطلاء الخارجي أمرا بالغ الأهمية للثقافات الناجحة. اسمح للطيات العصبية بالاستقرار على الجانب المقطوع لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، ثم انقلها ببطء إلى الحاضنة لتشجيع الالتصاق.

وتشمل الاختلافات في هذه التقنيات التلاعب الجيني العابر قبل الزراعة والتصوير بفاصل زمني أثناء الحضانة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا البروتوكول بجمع مجموعات خلايا القمة العصبية المهاجرة والمهاجرة للتحليل على مستوى omics.