إظهار تعصيب الجلد المشعر و Glabrous في نمط 3D باستخدام أساليب تلطيخ الفلورسنت المتعددة وإزالة الأنسجة
May 20th, 2022
حد سمك أقسام الأنسجة من الدراسة المورفولوجية لتعصيب الجلد. يصف هذا البروتوكول تقنية فريدة لإزالة الأنسجة لتصور الألياف العصبية الجلدية في أقسام الأنسجة السميكة التي تبلغ سماكتها 300 ميكرومتر تحت المجهر البؤري.
قدم بروتوكولنا طريقة مجدية لمراقبة قسم المزامنة باستخدام المجهر البؤري ، والذي يمكن أن يضمن الدقة في مراقبة الألياف العصبية. بروتوكول تنظيف الأنسجة البسيط والسهل هو الميزة الرئيسية لهذه التقنية. عملية تنظيف الأنسجة فعالة وتستغرق حوالي 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
إجراء التروية على الفئران التي تم قتلها رحيما كما هو مذكور في مخطوطة النص. استخدم مشرطا لإزالة جلد الظهرية والنعل من المخلب الخلفي. بالنسبة للعينات التي تتطلب قسما مجمدا ، قم بإصلاح الأنسجة بنسبة 4٪ من الألدهيد في 0.1 PB مولي لمدة ساعتين.
بعد الغسيل ، قم بتضمين أنسجة الجلد في 2٪ من الأغاروز عند 37 درجة مئوية وضعها داخل صندوق الثلج للتبريد. قم بإصلاح الأنسجة المثبتة على الميكروتون الاهتزازي بالماء المثلج وقم بتقطيعها بسماكة 500 ميكرومتر في الاتجاه المستعرض. بعد التقطيع ، قم بإزالة الأغاروز من الأقسام وتخزينها في لوحة من ستة آبار مع 1x PBS.
احتضان أقسام الأنسجة في محلول 2٪ triton X-100 في 1x PBS بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ضع أقسام الأنسجة في المخزن المؤقت المانع وقم بتدويرها بمعدل 72 دورة في الدقيقة على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. انقل أقسام الأنسجة إلى المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية للأجسام المضادة للفأر أحادي النسيلة المضاد ل CGRP والأغنام متعددة النسيلة المضادة LYVE-1 في مخزن مؤقت للتخفيف في أنبوب الطرد المركزي الصغير.
ثم تدور على الخلاط لمدة يومين عند أربع درجات مئوية. اغسل أقسام المناديل مرتين باستخدام مخزن الغسيل المؤقت في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتفظ بها على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية في مخزن الغسيل. في اليوم التالي ، انقل مقاطع الأنسجة إلى المحلول المختلط الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في أنبوب طرد مركزي صغير وقم بتدويرها بمعدل 72 دورة في الدقيقة على الخلاط لمدة خمس ساعات عند أربع درجات مئوية.
اغسل أقسام الأنسجة في صفيحة من ستة آبار مع مخزن مؤقت للغسيل مرتين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بأقسام الأنسجة في الغسيل العازل على الخلاط طوال الليل عند أربع درجات مئوية. انقل مقاطع الأنسجة إلى كاشف إزالة الأنسجة وقم بتدويرها بمعدل 60 دورة في الدقيقة على الخلاط بلطف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
قم بتركيب الأنسجة الشفافة على الشريحة ثم قم بتدوير الأنسجة باستخدام فاصل والتمسك بالفجوة باستخدام كاشف إزالة الأنسجة الطازجة وغطاء الانزلاق. أظهر نمط 3D أن الألياف العصبية الإيجابية CGRP مرت عبر الأنسجة والأدمة تحت الجلد إلى البشرة. ركضت هذه الألياف العصبية في حزم في الأنسجة تحت الجلد المتفرعة داخل الأدمة وانتهت في البشرة.
في المقابل ، يتم توزيع الفيلويدين في الأوعية الدموية الإيجابية والأوعية اللمفاوية الإيجابية LYVE-1 في الأنسجة تحت الجلد والأدمة. بشكل عام ، ركضت الألياف العصبية الإيجابية CGRP بالتوازي مع أو تحيط بالأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية التي تشكل شبكة 3D في الجلد المشعر والزجاجي. مع النهج التقليدي ، على الرغم من أن الأوعية الدموية للألياف العصبية والأوعية اللمفاوية كانت موسومة بوضوح ب CGRP phalloidin و LYVE-1 في الأقسام الرقيقة ، إلا أن مراقبة هذه الهياكل كانت محدودة بسمك الشريحة ولا يمكن ملاحظتها تماما.
في القسم الذي يبلغ سمكه 30 ميكرومتر ، لم يكن هناك فرق بين الجلد المشعر والجلد اللامع في مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP. في أقسام الأنسجة السميكة التي يبلغ سمكها 300 ميكرومتر ، مقارنة بالجلد المشعر ، زادت مساحة سطح الألياف العصبية الإيجابية CGRP للجلد الزجاجي بشكل كبير. من المهم استخدام مخزن التنظيف العازل ذو الضغط الأسموزي العالي بعد حضانة الأجسام المضادة.
عدة مرات ، من الضروري تحديد وقت التنظيف اللازم لتلطيخ التألق المناعي. بعد هذا الإجراء ، نعتقد أن هناك إمكانية لتلطيخ ومراقبة الأنسجة والأعضاء الأخرى في ستة أقسام موجودة أيضا. يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين في علم الأعصاب على مواجهة مساحة السطح وحالة الألياف العصبية.
كما أنه يساعدنا على مراقبة ابتكار الأنسجة والأعضاء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة تقنية جديدة لتصفية الأنسجة لتصوير ألياف الأعصاب الجلدية في أقسام الأنسجة السميكة التي يبلغ سمكها 300 ميكرومتر باستخدام التصوير المجهري التوافقي. تعمل الطريقة على تعزيز الدراسة المورفولوجية لتعصيب الجلد، وتعالج القيود المفروضة على التقطيع الرفيع التقليدي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تصوير الأنسجة
- التصوير المجهري التوافقي
الخلفية
- دراسة تعصيب الجلد أمر بالغ الأهمية لفهم المسارات الحسية.
- الطرق التقليدية محدودة برقة أقسام الأنسجة.
- تصوير ألياف الأعصاب في أقسام أكثر سمكا يمكن أن يوفر رؤى أعمق.
- تهدف الطريقة إلى تعزيز دقة التصوير وكفاءته.
هدف الدراسة
- تطوير والتحقق من تقنية تصفية الأنسجة لأقسام الجلد السميك.
- تسهيل ملاحظة ألياف الأعصاب وعلاقتها بالأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية.
- توفير طريقة يمكن تكييمها لدراسة الأنسجة والأعضاء الأخرى.
الطرق المستخدمة
- تم استخدام التصوير المجهري التوافقي لتصوير ألياف الأعصاب في أقسام الأنسجة المصفاة.
- شمل النموذج البيولوجي فئران تم قتلها، مع التركيز بشكل خاص على جلد الظهر والقدم الخلفية.
- وشملت الخطوات الرئيسية تروية الأنسجة، والتضمين، وتلطيخ الأجسام المضادة، وتصفية الأنسجة.
- عادةً ما يستغرق بروتوكول التطهير والتصوير من 30 دقيقة إلى ساعة.
النتائج الرئيسية
- نجحت تقنية التصفية في الكشف عن ألياف الأعصاب الإيجابية لـ CGRP التي تشكل شبكة ثلاثية الأبعاد داخل الجلد.
- أظهرت النتائج اختلافات كبيرة في توزيع ألياف الأعصاب بين الجلد الشعري والجلد غير الشعري.
- سمحت الطريقة بملاحظة تفصيلية للعلاقات الهيكلية مع الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية.
- تبين أن الألياف الإيجابية لـ CGRP تعمل بالتوازي مع أو تحيط بالأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية.
الاستنتاجات
- تعزز هذه التقنية القدرة على تصوير ودراسة تعصيب الجلد بشكل شامل.
- قد يساهم التصوير المحسن في تقديم رؤى قيّمة حول الآليات العصبية الحيوية.
- تمتد التطبيقات المحتملة إلى أنسجة وأعضاء مختلفة، مما يعزز أبحاث علم الأعصاب الأوسع.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Three-dimensional visualization of skin innervation using thick tissue sections and multiplex fluorescent staining addresses a critical gap in mapping peripheral nerve architecture. This approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling comprehensive analysis of nerve, blood, and lymphatic vessel interactions in disease-relevant skin models. The method supports translational continuity for neurobiology and dermatology-focused R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed mapping of sensory nerve fiber distribution in both hairy and glabrous skin.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships between nerves and vasculature.
- Improves predictive confidence for target validation in peripheral nervous system research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated 3D skin models for downstream phenotypic screening.
- Enhances assay reproducibility by standardizing tissue clearing and staining protocols.
- Provides quantitative outputs on nerve fiber surface area and network complexity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling both hairy and glabrous skin innervation.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neurocutaneous targets.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing structural biomarkers in skin tissue.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model development.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on nerve-vasculature interactions in skin.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D readouts for assay development.
- Analytics: Provides surface area measurements and network mapping for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment in disease-relevant skin models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to other tissues and organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in nerve mapping.
- Operational Value: Streamlines tissue processing with efficient clearing and staining workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust 3D data for target evaluation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurocutaneous and dermatological programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and multiplex immunofluorescence.
- Demands access to tissue clearing reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining and clearing protocols.
- Adaptable to various tissue types with protocol optimization.
- Dependent on antibody quality and clearing efficiency for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Perfusion, Triple Fluorescent Staining, and Tissue Clearing Treatment
3:10
Results: Enhanced Understanding of the Skin Innervation via Immunofluorescence and a 3D View of the Cutaneous Nerve Fibers in the Hairy and Glabrous Skin
4:31
Conclusion
