قياس القوى مباشرة داخل حزم الأنابيب الدقيقة النشطة المعاد تشكيلها

يسمح بروتوكولنا للباحثين ببناء زخارف هيكلية خلوية من مكونات نقية وقياس القوى التي تولدها هذه الشبكات مباشرة من أجل فهم كيفية عمل هذه المكونات الميكانيكية للخلية في كل من الحالات الصحية والمرضية. تسمح لنا هذه الطريقة بتحديد القوى وربط هذه الأرقام مباشرة للحفاظ على معلمات البروتينات المعنية ، بما في ذلك تركيز البروتين وكثافته. المعلمات التي يستحيل الحصول عليها بشكل عام داخل الخلية.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لأي نوع من شبكات الهيكل الخلوي ، مثل تلك المشاركة في الانقسام أو التطور العصبي. يمكن تكييفها بسهولة لدراسة الشبكات المشاركة في تقلص العضلات أو هجرة الخلايا ببساطة عن طريق تبديل هذه البروتينات المحددة المستخدمة. الجانب الأصعب في هذه الطريقة هو تنسيق التقنيات المختلفة ، والتي تشمل مصيدة بصرية أحادية الحزمة ، ومجهر TIRF.

بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب تجارب الجزيء الواحد إعدادا دقيقا للأسطح ، مثل زلة الغطاء ، لذا فإن إعداد عينات عالية الجودة أمر بالغ الأهمية. ابدأ ببناء غرفة رطوبة عن طريق وضع منديل مطوي وخالي من النسالة مبلل بماء فائق النقاء في الجزء السفلي من صندوق طرف ماصة فارغ. أدخل جميع الكواشف عن طريق سحب السائل في أحد طرفي القناة وفتل السائل في الطرف المقابل.

باستخدام طرف ماصة بزاوية 20 ميكرولتر ، تدفق ببطء في 10 ميكرولتر من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر ستربتافيدين أو نيوترافيدين. احتضان الشريحة في غرفة الرطوبة لمدة 4 دقائق مع انزلاق الغطاء متجها لأسفل. اغسل الحجرة باستخدام 20 ميكرولتر من 1x BRB80 باستخدام منديل خال من النسالة لسحب السوائل.

بعد تكرار الكواشف المتدفقة والحضانة مرة أخرى ، قم بمسح الخطوة باستخدام 10 ميكرولتر من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من محلول حجب الكازين. قم بتدفق 10 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة المخففة ذات اللون الأحمر البعيد إلى الغرفة ، ثم اغسل الغرفة ب 20 ميكرولترا من 1x BRB80. بعد تدفق الكاشف والتحضين كما هو موضح سابقا ، اغسل الخطوة ب 10 ميكرولتر من تركيز مناسب من البروتين غير الحركي المراد دراسته ، ثم تدفق 10 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة للرودامين وكرر الحضانة والتنظيف.

بعد ذلك ، اجمع بين 1 ميكرولتر من الخرز المطلي بالكينيسين الصارم و 19 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل. أغلق حافتي الحجرة بطلاء أظافر شفاف وانتظر حتى يجف الطلاء. استخدم أداة مجهر مقلوبة تتمتع بقدرات تصوير مضان انعكاس داخلي كاملة ، والتي تم فيها إنشاء مصيدة بصرية أحادية الحزمة.

أضف 1 قطرة من زيت الغمر على زلة غطاء غرفة العينة. مع توجيه جانب انزلاق الغطاء لغرفة العينة لأسفل ، ضع العينة المراد تصويرها على منصة المجهر. ارفع الهدف ببطء بحيث يكون هناك اتصال بين كل من زلة الغطاء والهدف من خلال الزيت.

اضبط الارتفاع المستهدف بحيث يكون سطح انزلاق الغطاء لحجرة العينة في بؤرة التركيز. سجل صورا أحادية الإطار للعينات في جميع القنوات الثلاث. بالنسبة للتجارب هنا ، استخدم 100 إلى 200 مللي ثانية من التعرض.

اضبط طاقة الليزر لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة من العينات مع تقليل تبييض الصور خلال 2 إلى 5 دقائق عند فحص الحزمة الفردية. يجب أن يكون تواتر حزم الأنابيب الدقيقة لكل مجال رؤية ما يقرب من ثلاث إلى أربع حزم من الأنابيب الدقيقة لكل 100 ميكرولتر في مجال رؤية 100 ميكرولتر لكل غرفة. لاحظ كثافة الخرز في العينة باستخدام مجال ساطع وهدف 100x على المجهر.

استخدم تركيزا من الخرز بحيث تكون الخرز على بعد 10 ميكرومتر على الأقل من بعضها البعض في المتوسط ، وتأكد من خلوها من أي نوع من الحبس السطحي أو التكتل. تأكد من أن الأنابيب الدقيقة ذات اللون الأحمر البعيد البيوتينيل متصلة بإحكام بسطح الغطاء تنزلق وأن الرودامين بدون حركة براونية مرئية. تأكد من أن الأنابيب الدقيقة للرودامين متصلة بالأنابيب الدقيقة البيوتينية عبر خريطة الربط المتقاطع وتتقلب بشكل واضح في نهاياتها الحرة.

حدد حزمة الأنابيب الدقيقة المناسبة التي تحتوي على اثنين فقط من الأنابيب الدقيقة ، واحدة بيوتينيل مع ملحق السطح الكامل وواحدة غير biotinylated microtubule التي هي حرة جزئيا في المحلول ومحاذاة إما على المحور x أو y. استخدم المصيدة البصرية لالتقاط حبة حرة توضح الحركة البراونية. بمجرد حبس الخرزة ، حرك الخرزة بعناية إلى حزمة الأنابيب الدقيقة المحددة لضمان عدم سحب أي خرزات أخرى إلى المصيدة في هذه العملية.

تأكد من أن الخرزة تبعد عدة ميكرونات عن المنطقة المتداخلة التي تحتوي على بروتينات متقاطعة. اخفض الخرزة بعناية في المحور z حتى تتلامس مع حافة الجزء الحر من الأنابيب الدقيقة للرودامين. اسحب لأعلى برفق وتحرك بشكل عمودي على محور الأنابيب الدقيقة للتحقق من التعلق من خلال مراقبة ثني الأنابيب الدقيقة الرودامين واتباع موضع الخرزة.

أعد محاذاة الأنابيب الدقيقة للرودامين بعناية على طول محور الأنابيب الدقيقة للأنيبيبات الدقيقة المتصلة بالسطح عن طريق تحريك مرحلة تحديد المواقع النانوية وإعداد معلمات السحب الآلي لحزمة الأنابيب الدقيقة. اضبط الاتجاه على طول المحور الموازي للأنابيب الدقيقة. اضبط سرعة السحب المطلوبة ووقت السحب المطلوب حسب طول التداخل.

ابدأ في تسجيل بيانات التألق في القنوات الثلاث بمعدل 1 إلى 2 إطار في الثانية. استخدم قوى الليزر المحسنة وأوقات التعرض. ابدأ حركة المسرح المؤتمتة وسجل بيانات الملائمة من مرحلة الكاشف الحساسة للموضع ومرحلة الكاميرا الفلورية للانعكاس الداخلي الكلي.

قم بإلغاء تنشيط الفخاخ لتحرير الخرزة وكرر التجربة حسب الرغبة. يمكن لمجموعات البروتين الحركي الانقسامي الأساسي kinesin-5 تنظيم انزلاق الأنابيب الدقيقة عن طريق توليد كل من قوى الدفع والكبح التي تتدرج خطيا مع طول التداخل. وقد وجد أن مجال ذيل C-terminal مطلوب للربط المتقاطع الفعال وتوليد القوة.

البروتين كامل الطول قادر على توليد قوى مستدامة تستقر عندما تصل جميع البروتينات الحركية إلى قوة التوقف الفردية. ومع ذلك ، فإن محرك kinesin-5 الذي يفتقر إلى ذيله الطرفي C يولد قوى قصوى أصغر بخمسة أضعاف تقريبا في الحجم. تعمل مجموعات البروتين الانقسامي غير الحركي PRC1 كجراب اندفاعة ميكانيكي لمقاومة انزلاق الأنابيب الدقيقة في منطقة منتصف مغزل الطور الطوري.

لا تعتمد قوى المقاومة على طول مناطق التداخل بين أزواج الأنابيب الدقيقة أو كثافة الروابط المتشابكة المحلية ، ولكنها تعتمد بشدة على التركيز الكلي لجزيئات PRC1 المشاركة. يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة الأنظمة البيولوجية المتنوعة مثل التنظيم الميكروبي والخلايا العصبية باستخدام بروتينات بديلة. يمكن أيضا توسيعه بسهولة لتحليل هندسة الشبكة القائمة على الأكتين لدراسة تقلص العضلات أو حركة الخلية.

تتيح هذه التقنية للمرء دراسة الهندسة الكلية الفريدة للخلايا ، حيث تكون الخيوط على حد سواء المسار والشحن ويتم تنظيمها بواسطة مجموعات صغيرة من البروتينات. تحاكي هذه الأشكال الهندسية بشكل أفضل ما يحدث في الخلايا خلال العديد من العمليات البيولوجية.