رقاقة كبيبات الكلى متساوية المنشأ المصممة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

ستمكن رقاقة الكبيبات متساوية المنشأ من نمذجة الأمراض الخاصة بالمريض واختبار السمية الكلوية وتطبيقات الطب الدقيق المتقدمة. تستمد الظهارة الكبيبية والبطانة من مجموعة واحدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، أو IPSCs. تمتلك IPSCs تجديدا ذاتيا غير محدود ويمكنها التمييز في أي نوع من الخلايا تقريبا.

يمكن استخدام هذه التقنية لتقييم الأنماط الظاهرية الخلوية المرضية والمرض. يمكن أن تكون رقاقة الأعضاء الخاصة بالمريض أيضا بمثابة منصة لفحص الأدوية والدراسات الميكانيكية. يمكن تطبيق هذا النموذج على تطوير جسم على نظام رقاقة مخصص لمريض معين.

هذا النظام لديه القدرة على التنبؤ بالاستجابات الخاصة بالمريض قبل الاختبار السريري. ابدأ بإضافة 25 ميكرولتر بلطف من محلول مصفوفة الغشاء السفلي 2 إلى القناة البولية و 20 ميكرولتر إلى القناة الشعرية للرقاقة. خذ غطاءين من الأنبوب المخروطي المعقم سعة 15 ملليلتر واملأهما ب 500 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم.

ضع الغطاء في طبق بتري لمنع التجفيف وضع الغطاء على الطبق. احتضنه عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. المضي قدما ، استنشاق الوسط من قوارير T75 التي تحتوي على مزرعة لمدة 15 يوما من الخلايا البطانية الوعائية عند التقاء 90٪.

أضف خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت لانفصال الخلايا واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وأضف خمسة ملليلترات من DMEM / F-12. جهاز طرد مركزي بسرعة 200 مرة G لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة السوبرناتانت وإعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من وسط الصيانة البطانية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم للحصول على ما يقرب من 2 مليون خلية. باستخدام طرف حاجز P200 ، اغسل كل من القنوات العلوية والسفلية لشريحة الموائع الدقيقة ب 200 ميكرولتر من DMEM / F-12 أثناء السحب في نفس الوقت من محيط المخرج.

أمسك الشريحة بإحكام باستخدام طرف الحاجز P200 المتصل بالشافطة بعيدا عن مخرج القناة السفلية. حقن بقوة 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية الوعائية في القناة الشعرية للرقاقة وشفط الوسط بعناية من محيط المخرج. تحقق تحت المجهر من وجود فقاعات أو كثافة بذر غير متساوية.

قم بعكس الشريحة بلطف حتى تتمكن الخلايا من الالتصاق بالجانب القاعدي من غشاء PDMS المرن. ضع الشريحة في خرطوشة الحامل وأضف ثلاثة ملليلترات من PBS إلى الخرطوشة لمنع الغشاء من الجفاف. احتضن الشريحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

تحقق من القناة السفلية تحت المجهر بحثا عن طبقة متقاربة من الخلايا المرتبطة بغشاء PDMS المرن. اغسل الخلايا غير المتصلة بإضافة 200 ميكرولتر من وسيط الصيانة البطانية على مدخل القناة السفلية أثناء الشفط من محيط منفذ القناة الشعرية. ضع الشريحة مرة أخرى في خرطوشة الحامل واحتضنها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، اغسل القناة الشعرية بلطف مع 200 ميكرولتر من وسط الصيانة البطانية. اغسل القناة البولية ب 200 ميكرولتر من DMEM / F-12 وأسقط 50 ميكرولتر من DMEM / F-12 على منافذ المدخل والمخرج. المضي قدما في خلايا الأديم المتوسط الوسيطة ، استبدل وسط تحريض الأديم المتوسط المتوسط من كل بئر من صفيحة البئر ال 12 بملليلتر واحد من Trypsin EDTA واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

كشط الخلايا بلطف باستخدام رافع الخلايا وفصل الخلايا باستخدام السحب. أضف ملليلترين من محلول تحييد التربسين إلى كل بئر وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. اجعل حجم تعليق الخلية يصل إلى 50 ملليلتر باستخدام DMEM / F-12 وأجهزة الطرد المركزي عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق.

شفط السوبرناتانت وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من وسط تحريض الأديم المتوسط المتوسط للحصول على ما يقرب من 3 ملايين خلية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. أمسك الشريحة وحقن 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا بإحكام في القناة البولية للرقاقة أثناء شفط الوسط بعناية من محيط المخرج.

تحقق من وجود فقاعات أو كثافة بذر خلايا غير متساوية. أضف ثلاثة ملليلترات من PBS إلى خرطوشة حامل الشريحة واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة ، اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الخاص بكل منهما.

قم بتوصيل أطراف حاجز P200 الفارغة في كل من منافذ القنوات البولية والشعيرات الدموية. ماصة 200 ميكرولتر من وسط الصيانة البطانية وحقن نصفها في مدخل القناة الشعرية. حرر طرف الماصة داخل المدخل بحيث يتم توصيل كل من مدخل ومخرج القناة بأطراف ماصة مملوءة بمتوسطة.

كرر هذا الإجراء لمدخل القناة البولية مع 200 ميكرولتر من وسيط صيانة الأديم المتوسط المتوسط. احتضن الرقائق بأطراف مدمجة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. لتوصيل الرقائق بالمفاعل الحيوي لرقاقة الجهاز ، أولا ، قم بإزالة نصائح P200 من القنوات.

أضف قطرات من الوسائط المعنية إلى مدخل ومخرج القنوات البولية والشعرية لمنع التجفيف. أضف ثلاثة ملليلترات من وسط تحريض الخلايا البودوسية الدافئة إلى خزان مدخل البول وثلاثة ملليلتر من وسط الصيانة البطانية الدافئة إلى خزان مدخل الشعيرات الدموية. أضف 300 ميكرولتر من الوسائط المعنية إلى خزانات المخرج مباشرة فوق منفذ المخرج.

حرك القرون على الدرج وفي المفاعل الحيوي لرقاقة العضو. استخدم القرص الدوار لتحديد الدورة الرئيسية وتشغيلها لمدة دقيقتين. افحص بصريا الجانب السفلي من الجراب بحثا عن قطرات صغيرة في جميع المنافذ المائعة الأربعة.

لتحقيق ملامسة السوائل بين الجانب السفلي من الجراب ومنافذ رقاقة الموائع الدقيقة ، حرك حامل الشريحة برفق في الجرب. اضغط برفق على علامة التبويب حامل الشريحة للداخل ولأعلى. استنشاق الوسط الزائد من سطح الشريحة.

اضبط معدل تدفق المفاعل الحيوي لرقاقة العضو على 60 ميكرولتر في الساعة. اضبط السلالة الدورية على 10٪ عند 0.4 هرتز. استخدم القرص الدوار الموجود في المفاعل الحيوي لرقاقة العضو لتحديد دورة التنظيم وتشغيله لمدة ساعتين.

افحص بصريا خزانات المخرج بحثا عن زيادة في مستوى الوسط. استخدم القرص الدوار الموجود في المفاعل الحيوي لرقاقة العضو لتحديد دورة التنظيم. بعد اليوم 17 من الثقافة، قم يوميا بشفط الوسط من خزانات مخرج القناة البولية قطريا بعيدا عن الميناء ولكن احتفظ ببعض الوسائط في الخزان.

قم بتجديد خزان مدخل القناة البولية بما يصل إلى ثلاثة ملليلتر من وسط تحريض الخلايا البودوسيتية كل يومين لمدة خمسة أيام. بعد خمسة أيام ، استطلع الوسط من القناة البولية ولكن احتفظ ببعض الوسائط في الخزان. قم بتجديد خزان مدخل القناة البولية يوميا بثلاثة ملليلتر من وسيط صيانة الخلايا البودوسيتية.

وبالمثل ، قم بشفط الوسط من مخرج القناة الشعرية وقم بتجديد خزانات المدخل يوميا باستخدام وسيط الصيانة البطانية. باستخدام هذا البروتوكول ، تم استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان لتطوير نموذج وظيفي في المختبر للكبيبات عن طريق نشر الخلايا البطانية الوعائية والخلايا الوعائية. في اليوم 21 بعد تحريض الخلايا البودوسية وانتشار بطانة الأوعية الدموية ، عبرت الخلايا الموجودة داخل الرقائق عن علامات تحديد النسب مثل Podocin و Nephrine لخلايا podocytes و VE Cadherin و PECAM-1 للخلايا البطانية الوعائية.

عبرت كل من طبقات الخلايا البطانية الوعائية والأوعية الدموية عن الكولاجين IV وهو بروتين GBM الأكثر وفرة في كبيبات الكلى. قامت رقائق الكبيبات بتصفية جزيئات صغيرة بشكل انتقائي مثل الأنسولين من الشعيرات الدموية إلى القناة البولية ، مع منع البروتينات الكبيرة مثل الألبومين من مغادرة القناة الشعرية ، مما يدل على وظيفة ترشيح جزيئي انتقائية. أثناء الحث البطاني في الأيام من الرابع إلى السابع ، قد تؤدي الزيادة في عدد الخلايا إلى طبقة ثانوية من الخلايا ولكن الإفراط في البذر قد يسبب تجميعا يمكن أن يعيق التمايز.

يمكن ملاحظة تدفق سائل متقاطع غير متوقع بين القنوات البولية والشعيرات الدموية في حالة عدم كفاية الترابط بين مكونات شريحة PDMS ، أو انسداد في مسار تدفق السوائل ، أو حاجز ترشيح معرض. عند البذر البطاني والظهارة والحفاظ على الرقائق من الأيام 15 فصاعدا ، من المهم فحص فقاعات الهواء بصريا في القنوات في كل خطوة. في رقاقة الكبيبات متساوية المنشأ ، يمكن إعطاء الأدوية المرشحة ذات الصلة سريريا لاختبار إمكاناتها العلاجية أو مستويات السمية.

تفتح هذه التقنية الآن فرصا لفهم الأساس الجيني لأمراض الكلى البشرية وتطوير علاجات شخصية.