Name: الحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: تعلم بروتوكول الحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام كنموذج للعين البشرية. تُستخدم هذه الطريقة لتوصيل العلاج الجيني لعلاج التنكس الشبكي بطريقة أقل توغلاً.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ستيف هيب (BVSc ، CertVOphthal) لمساعدته في إنشاء هذا البروتوكول وإجراء الحقن التي وصفها موراي وآخرون 15. يقر المؤلفون أيضا بالتمويل من CureKids New Zealand ، ومؤسسة كانتربري للأبحاث الطبية ، وشركة Neurogene Inc ، وجمعية دعم وأبحاث مرض باتن.

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة لينكولن وتتماشى مع إرشادات المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة لرعاية الحيوانات واستخدامها في الأبحاث وقانون رعاية الحيوان النيوزيلندي (1999). تم تشخيص أغنام بوردرديل عند الولادة14 وتم الاحتفاظ بها في مزارع أبحاث جامعة لينكولن. تلقت ثلاث نعاج متماثلة الزيجوت (CLN5-/-) تبلغ من العمر 3 أشهر حقنة IVT واحدة في العين اليسرى ، مع عمل العين اليمنى غير المعالجة كعنصر تحكم داخلي. تمت مقارنة بيانات تخطيط كهربية الشبكية وعلم الأمراض ببيانات التحكم التاريخية الصحية والمتأثرة. كان الناقل الفيروسي المستخدم في هذه الدراسة عبارة عن فيروس مرتبط بالغدي مكمل ذاتيا من النمط المصلي 9 ، يحتوي على مروج عمل بيتا الدجاج (CBh) والأغنام CLN5 المحسنة للكودونات (scAAV9 / CBh-oCLN5opt). تم توفير الناقل الفيروسي من قبل جامعة نورث كارولينا فيكتور كور ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية.
1. قبل الجراحة
<ol><li>الأوتوكلاف عدة الجراحية (الشكل 1).</li>
	<li>صوم الأغنام لمدة 24 ساعة قبل الجراحة.</li>
	<li>سجل الأوزان الحية قبل الجراحة.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig01.jpg"> الشكل 1: طقم الجراحة داخل الجسم الزجاجي. تشمل الأدوات المطلوبة لجراحة IVT (1) منظار لإبقاء الجفون مفتوحة و (2) زوج من ملقط الأنف المنحني للإمساك بالملتحمة البصلية وتدوير العين. (3) يتم تضمين مرقئ الأنف المستقيم أيضا كأداة بديلة للإمساك بالملتحمة البصلية وتثبيت العين في مكانها إذا عادت إلى مدار العين. يتم تعقيم هذه المجموعة قبل الجراحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
2. الإجراء الجراحي
<ol><li>كبح جماح الحيوان ، وباستخدام كليبرز الإلكترونية ، حلق الصوف من جانب واحد من الرقبة على الوريد الوداجي.</li>
	<li>قم بسد الوريد الوداجي عن طريق الضغط على قاعدة الأخدود الوداجي وتصور الوريد المرتفع.</li>
	<li>ضع الكمية المناسبة من الديازيبام (0.3 ملغ/كغ) والكيتامين (7.5 ملغ/كغم) في حقنة معقمة وأرفق إبرة معقمة وزنها 20 غ. أدخل الإبرة في الوريد الوداجي واسحب المكبس برفق للتأكد من دخول الدم إلى المحور وأن الإبرة داخل الوريد. بمجرد التأكيد ، يتم الحث من خلال الحقن الوريدي (الوداجي).</li>
	<li>مباشرة بعد الحث ، ضع الحيوان في راقد ظهري ، ومد الرقبة ، وأمسك اللسان لأعلى وللأمام ، باستخدام منظار الحنجرة لتصور الحنجرة. قم بإجراء التنبيب الرغامي عن طريق إدخال أنبوب القصبة الهوائية برفق (الحجم 6.0-9.0 حسب حجم الأغنام) بين الحبال الصوتية عند زفير الحيوان. قم بنفخ الكفة الرغامية على الفور وقم بتأمين الأنبوب برباط حول الفك السفلي. تأكد من تدفق الهواء عبر الأنبوب.</li>
	<li>نقل الأغنام إلى طاولة الجراحة ووضعها في راقد جانبي.</li>
	<li>قم بتوصيل أنبوب القصبة الهوائية على الفور بخراطيم آلة التخدير لتوصيل إيزوفلوران في أكسجين 100٪. ابدأ في البداية ب 3٪ -4٪ إيزوفلوران ثم قلل إلى 2٪ -3٪ للصيانة. مراقبة التهوية التلقائية للأغنام.</li>
	<li>مراقبة معدل ضربات القلب (النبض) ، ومعدل التنفس ، وتشبع الأكسجين ، ومستويات CO2 في نهاية المد والجزر ، ودرجة حرارة الجسم المستقيم طوال العملية. انظر الجدول 1 لمعرفة القيم الفسيولوجية لهذه المعلمات في الأغنام المخدرة (متغير ، ولكن يستخدم كإرشاد).</li>
	<li>ضع ستارة كبيرة ومعقمة ومربعة على عربة العمليات الجراحية ، متبوعة بالأدوات المعقمة.</li>
	<li>ضع ستارة جراحية معقمة ومغطاة على العين المراد حقنها.</li>
	<li>تطهير العين بشكل معقم باستخدام حقنة معقمة سعة 20 مل لري العين بمحلول بوفيدون اليود 1-5٪.</li>
	<li>ضع 1-2 قطرات من Alcaine 0.5٪ W / V محلول العيون ، كمخدر موضعي ، على العين.</li>
	<li>قم بتركيب منظار العين Nopa Barraquer-Colibri (10 مم) على الجفون لإبقاء العين مفتوحة.</li>
	<li>أمسك الملتحمة البصلية على الجانب الظهري الجانبي للعين بالملقط ، وقم بتدوير كرة العين من الناحية البطنية.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>واعي</td>
			<td>التخدير</td>
			<td>نقطة التدخل الحرجة الموصى بها</td>
		</tr><tr><td>معدل ضربات القلب (يدق / دقيقة)</td>
			<td>50-80 (بقية) إلى 280 (نشط)</td>
			<td>50-80</td>
			<td>&lt;50 ، &gt;100</td>
		</tr><tr><td>معدل التنفس (أنفاس / دقيقة)</td>
			<td>15-40 (بقية) إلى 350 (محموم)</td>
			<td>10-30</td>
			<td>&lt;8 , &gt;40</td>
		</tr><tr><td>تشبع الأكسجين (مم زئبق)</td>
			<td>95-100</td>
			<td>98-100</td>
			<td>&lt;90</td>
		</tr><tr><td>ثاني أكسيد الكربون في نهاية المد والجزر2 (مم زئبق)</td>
			<td>35-45</td>
			<td>35-45</td>
			<td>&gt;55</td>
		</tr><tr><td>درجة حرارة الجسم (°C)</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>&lt;36 ، &gt;40</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: القيم الفسيولوجية للمعلمات التي يجب مراقبتها في الأغنام المخدرة.
3. التحضير الفيروسي
<ol><li>قم بتخزين حصص ناقل AAV عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
	<li>في يوم الجراحة ، قم بإذابة العدد المطلوب من القوارير لتسليم IVT على الجليد.</li>
	<li>مباشرة قبل الإعطاء ، دوامة القسمة الفيروسية الناقل وأجهزة الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 ثوان لجمع المحتويات.</li>
	<li>قم بتخفيف كل قلمة ناقل فيروسي في محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS) إلى الجرعة المطلوبة في حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر. تحضير تخفيفات النواقل في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 مل منخفض البروتين باستخدام أطراف ماصة مرشح معقمة. تخلص من جميع المواد الاستهلاكية التي كانت على اتصال مع الناقل الفيروسي في محلول مطهر (انظر جدول المواد). ملاحظة: في المنشور الأصلي15 جرعة العامل العلاجي (AAV9. CLN5) كان 1.9 × 1010 جينومات فيروسية. تختلف الجرعة الموصى بها اعتمادا على العامل العلاجي الذي يتم إعطاؤه. لذلك ، لم يتم تضمين جرعة في البروتوكول القياسي المقدم هنا.</li>
	<li>ارسم 100 ميكرولتر كاملة من مستحضر ناقل AAV في حقنة معقمة منخفضة الميتة سعة 1 مل مع إبرة 28 جم × 1/2 متصلة بشكل دائم للحقن الفوري. تأكد من أن طول الوقت من التحضير إلى الحقن أقل من 2 دقيقة.</li>
</ol>4. الإدارة الفيروسية
<ol><li>أدخل الإبرة حوالي 7 مم خلف الصلبة على الجانب الجانبي للعين وزاوية خلفية لتجنب العدسة (الشكل 2 والشكل 3). تطبيق حقنة واحدة من 100 ميكرولتر كبلعة قريبة من شبكية العين قدر الإمكان دون إزعاج سطح الشبكية.</li>
	<li>شطف العين مع ما يقرب من 10-15 مل من 1-5 ٪ محلول بوفيدون اليود تليها 10 مل من المياه المالحة قبل إزالة المنظار والستارة.</li>
	<li>اقلب الخروف وكرر بالعين الأخرى إذا لزم الأمر.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig02.jpg"> الشكل 2: الدوران البطني لكرة العين . (أ) أمسك الملتحمة البصلية بالملقط غير المسنن و (ب) قم بالدوران البطني (أي لأسفل ونحو الخطم) لكشف السطح الظهري الوحشي للعين للحقن. الاختصارات: V = بطني ، D = ظهري ، M = وسطي ، L = جانبي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig03.jpg"> الشكل 3: موقع الحقن وعمقه. يتم حقن الإبرة على الجانب الظهري الجانبي من كرة العين ، ويتم إدخال الطول الكامل لعمود الإبرة (0.5 بوصة / 12.7 مم) في العين. لاحظ زاوية الإبرة باتجاه مؤخرة العين لتجنب العدسة والحقن بالقرب من شبكية العين قدر الإمكان. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
5. إدارة ما بعد الجراحة
<ol><li>عند الانتهاء من الإجراء ، أوقف التخدير باستنشاق غاز الأيزوفلوران ، واغسل الخط بالأكسجين بنسبة 100٪ ، وافصل الخرطوم عن أنبوب القصبة الهوائية ، وانقل الأغنام إلى غرفة الإنعاش.</li>
	<li>ضع الخروف في رقد القص ، مع وضع الأرجل تحته ، وراقبه حتى الشفاء التام. تأكد من خلو فم الحيوان من أي عوائق.</li>
	<li>عند ملاحظة منعكس البلع ، قم بتفريغ الكفة جزئيا من الأنبوب الرغامي وإزالة الأنبوب برفق من الفم.</li>
	<li>تطبيق مضاد التهاب غير ستيرويدي عضلي في العضلة ذات الرأسين الفخذية للطرف الخلفي، والمضادات الحيوية تحت الجلد على جانب الرقبة أو خلف الكتف، وقطرات العين الكلورامفينيكول 0.5٪ على سطح كرة العين.</li>
	<li>توفير الماء والغذاء (كريات لوسيرن والقشر) بمجرد أن تتمكن الأغنام من الوقوف دون مساعدة.</li>
	<li>يتم تطبيق 0.5٪ قطرات العين الكلورامفينيكول 2-3 يوميا لمدة 7 أيام بعد الجراحة.</li>
	<li>احتفظ بالأغنام في الداخل طوال الليل قبل العودة إلى الحلبة الخارجية بعد حوالي 24 ساعة من الجراحة.</li>
	<li>سجل درجات حرارة المستقيم يوميا لمدة 3 أسابيع. راقب أي تغييرات في النبض أو معدل التنفس ، واستهلاك الطعام ، والسلوك العصبي ، ودرجة حرارة الجسم ، والوزن ، والموقف ، وصحة العين ، والعلامات السريرية لاعتلال الصحة. اطلب العلاج البيطري المناسب إذا كانت هناك أي مؤشرات على الأحداث السلبية.</li>
</ol>6. تقييم الفعالية في الجسم الحي
<ol><li>إذا كان الهدف من حقن IVT هو الحفاظ على الرؤية ، راقب الفعالية في الجسم الحي بطرق مثل اختبار المتاهة أو تخطيط كهربية الشبكية (ERG) لتقييم وظيفة خلايا الشبكية أو التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) لتقييم بنية الشبكية. ملاحظة: تم وصف تدابير الفعالية هذه بشكل جيد بعد العلاج الجيني IVT11،15،16.</li>
</ol>7. تحليل الأنسجة بعد الوفاة
<ol><li>إجراء القتل الرحيم للأغنام بطريقة معتمدة في نقطة نهاية مناسبة بعد جراحة الحقن داخل الجسم الزجاجي. ملاحظة: طرق القتل الرحيم المقترحة ، مثل أدوية القتل الرحيم البيطرية عن طريق الوريد أو صاعقة أسيرة مخترقة للعمود الفقري العنقي متبوعة بالاستنزاف السريع ، مفصلة في مكان آخر15,16.</li>
	<li>حصاد كرات عين الأغنام باستخدام مقص منحني حاد / حادة جراحية. قم بقطع العلبة الجانبية والإنسية لزيادة فتحة محجر العين ثم قم بقطع طيات الملتحمة والنسيج الضام والعضلات والعصب البصري بشكل منهجي لتحرير كرة العين من التجويف.</li>
	<li>تثبيت الغمر سليم ، كرات العين منزوعة النواة في 10٪ فورمالين لمدة 2 ساعة ، تليها التثبيت اللاحق في محلول بوين لمدة 4 ساعات ، مما يجعل قطعا صغيرا (0.5 سم) في الصلبة للسماح بالتروية الكافية. بدلا من ذلك ، قم بإصلاح كرات العين في حل ديفيدسون لمدة 48 ساعة.</li>
	<li>معالجة أقسام أنسجة العين عن طريق تضمين شمع البارافين الروتيني وتقسيمه عند 3-5 ميكرومتر. ملاحظة: تم وصف إجراءات تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&amp;E) والتحليل الكيميائي المناعي سابقا15،16.</li>
	<li>تقييم الفعالية في أنسجة ما بعد الوفاة من خلال تدابير مثل سمك الشبكية الكلي ، وسمك طبقة الشبكية ، وعدد الصفوف الخلوية للطبقة النووية الخارجية ، والتلوين الكيميائي المناعي لأنواع خلايا الشبكية ، أو الدبقية في الشبكية ، أو البروتينات ذات الأهمية. ملاحظة: للاطلاع على بروتوكولات هذه التحليلات، انظر المنشورات السابقة15، 16.</li>
</ol>

<ol><li>Himawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+retinal+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to retinal photoreceptors.</a> Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).</li>
<li>Murray, S. J., Mitchell, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+therapies+for+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%3A+More+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye.</a> Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).</li>
<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li>
<li>Grzybowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((update+on+intravitreal+injections%3A+Euretina+expert+consensus+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations.</a> Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).</li>
<li>Pavlou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+AAV+capsids+for+intravitreal+gene+therapy+of+photoreceptor+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392(2021).</li>
<li>Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+mutation+spectrum+and+clinical+correlations+of+over+360+mutations+in+eight+genes+that+underlie+the+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).</li>
<li>Wibbeler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerliponase+alfa+for+the+treatment+of+atypical+phenotypes+of+CLN2+disease%3A+A+retrospective+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series.</a> Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+intraventricular+cerliponase+alfa+for+CLN2+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).</li>
<li>Mitchell, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+monitoring+of+the+CNS+demonstrates+the+efficacy+of+gene+therapy+in+a+sheep+model+of+CLN5+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease.</a> Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).</li>
<li>Murray, S. J., Mitchell, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+retinal+degeneration+in+ovine+models+of+CLN5+and+CLN6+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Scientific Reports. 12 (1), 3670(2022).</li>
<li>Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinography+data+from+ovine+models+of+CLN5+and+CLN6+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Data in Brief. 37, 107188(2021).</li>
<li>Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+and+allometric+prediction+of+vitreous+volume%2C+and+retina+and+lens+weights+in+G%C3%B6ttingen+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs.</a> Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).</li>
<li>Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+ganglion+cells+and+photoreceptors+in+the+sheep+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).</li>
<li>Frugier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+large+animal+model+of+CLN5+neuronal+ceroid+lipofuscinosis+in+Borderdale+sheep+is+caused+by+a+nucleotide+substitution+at+a+consensus+splice+site+%28c.571%2B1G%3EA%29+leading+to+excision+of+exon+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3.</a> Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).</li>
<li>Murray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+gene+therapy+protects+against+retinal+dysfunction+and+degeneration+in+sheep+with+CLN5+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease.</a> Experimental Eye Research. 207, 108600(2021).</li>
<li>Ross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+retinal+transduction+by+AAV2-7m8+following+intravitreal+injection+in+a+sheep+model+of+CNGA3+achromatopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia.</a> Gene Therapy. , (2021).</li>
<li>Boyd, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor-targeted+gene+delivery+using+intravitreally+administered+AAV+vectors+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs.</a> Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+visual+performance+with+intravitreal+administration+of+9-cis-retinal+in+Rpe65-mutant+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs.</a> Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).</li>
<li>Ross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+photoreceptor+transduction+efficacy+of+capsid-modified+adeno-associated+viral+vectors+following+intravitreal+and+subretinal+delivery+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).</li>
<li>Kotterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+neutralization+poses+a+barrier+to+intravitreal+adeno-associated+viral+vector+gene+delivery+to+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates.</a> Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).</li>
<li>Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immune+responses+to+AAV+gene+therapy+in+the+ocular+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment.</a> Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).</li>
<li>Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subconjunctival+hemorrhage+after+intravitreal+injection+of+anti-vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).</li>
<li>Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+needle+forces+and+acute+pressure+changes+during+intravitreal+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).</li>
<li>Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+pressure+and+injection+forces+during+intravitreal+injection+into+enucleated+porcine+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).</li>
<li>Ross, M., Ofri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+retinal+gene+therapy%3A+Evolving+from+subretinal+to+intravitreal+vector+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery.</a> Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).</li>
<li>Henein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+of+intravitreal+injections+into+liquid+vitreous+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes.</a> Pharmaceutics. 11 (8), 371(2019).</li>
<li>Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+intraocular+pressure+variation+during+automatic+intravitreal+injections%3A+An+ex-vivo+experimental+study+using+porcine+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes.</a> PloS One. 16 (8), 0256344(2021).</li>
<li>Willekens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreally+injected+fluid+dispersion%3A+Importance+of+injection+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).</li>
<li>Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+models+to+study+drug+delivery+barriers+in+the+posterior+segment+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).</li>
<li>Kiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Considerations+for+Ocular+Gene+Therapy.+Adeno-associated+virus+vectors+offer+a+safe+and+effective+tool+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Retinal+Physician%22%5BJournal%5D)">Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery.</a> Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+targeting+the+inner+retina+rescues+the+retinal+phenotype+in+a+mouse+model+of+CLN3+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+brain-directed+gene+therapy+rescues+a+mouse+model+of+neurodegenerative+CLN6+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease.</a> Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

الحقن داخل الجسم الزجاجي هي واحدة من أكثر العمليات الجراحية شيوعا في طب العيون البشري وقد أثبتت فعاليتها في تقديم العلاجات الجينية بوساطة AAV إلى شبكية الأغنام. لقد أثبتنا سابقا فعالية AAV9. قدم العلاج الجيني CLN5 داخل الجسم الزجاجي في تخفيف ضعف الشبكية وانحطاطها في الأغنام باستخدام CLN5 NCL15. ومن المأمول أن تكون ترجمة هذا الطريق من الإدارة لمرضى NCL من البشر مفيدة أيضا.
بروتوكول حقن IVT صغير الحجم في عين الغنم واضح نسبيا وغير جراحي ، وقابل للتكرار بسهولة ، ويسهل على غ...

يمكن استخدام عدة طرق لتوصيل العوامل العلاجية إلى شبكية العين ، بما في ذلك داخل الجسم الزجاجي (IVT) ، أو تحت الشبكية ، أو فوق المشيمية ، أو حول العين ، أو الموضعية. يتضمن كل طريق من طرق الإدارة التغلب على الحواجز مثل حاجز الدم والشبكية أو الأغشية الداخلية والخارجية المحددة وله معدلات متفاوتة من الفعالية اعتمادا على الدواء الذي يتم تسليمه وهدف الشبكية المحدد 1,2.
يتضمن توصيل الدواء IVT حقنا في الخلط الزجاجي للعين ، وهي مادة هلامية تحتل الغرفة الخلفية للعين. تتمثل الوظيفة الأساسية لخلط الجسم الزجاجي في الحفاظ على شكل كرة العين والحفاظ على أنسجة العين ، مثل العدسة والشبكية ، في مكانها. يتكون الخلط الزجاجي إلى حد كبير من الماء ، مع كميات صغيرة من الكولاجين وحمض الهيالورونيك والبروتينات غير الكولاجينية الأخرى3. حقن IVT هو إجراء بسيط وشائع يستخدم بشكل روتيني لعلاج مجموعة واسعة من حالات العين ، بما في ذلك التنكس البقعي المرتبط بالعمر ، والوذمة البقعية السكرية ، واعتلال الشبكية السكري ، وانسداد الوريد الشبكي ، والعديد من ضمور الشبكية الموروث 4,5.
ليبوفوسينوس سيرويد عصبي (NCL; مرض باتن) هي مجموعة من أمراض التخزين الليزوزومية القاتلة التي تسبب تنكسا شديدا في الدماغ والشبكية. يوجد حاليا 13 متغيرا معروفا من NCL ناتجة عن طفرات في جينات مختلفة (CLN1-8 ، CLN10-14) تؤثر في الغالب على الأطفال ولكن لها أعمار متفاوتة من البداية وشدة المرض6. تشترك NCLs في الأعراض التقدمية الشائعة ، بما في ذلك التدهور المعرفي والحركي والنوبات وفقدان الرؤية. لا يوجد علاج ل NCL. ومع ذلك ، فإن العلاج ببدائل الإنزيم الموجه للدماغ يخضع حاليا للتجارب السريرية لمرض CLN27,8 ، وقد أظهر العلاج الجيني بوساطة AAV وعدا كبيرا في الدراسات قبل السريرية ، مع تجربة سريرية للعلاج الجيني CLN5 من المتوقع أن تبدأ في عام 2022 9,10.
تطور العديد من الأنواع الأخرى أشكالا طبيعية من NCL ، بما في ذلك القطط والكلاب والأغنام والأبقار. يخضع حاليا نموذجان من الأغنام من NCL للدراسة النشطة في نيوزيلندا: نموذج مرض CLN5 في أغنام بوردرديل ونموذج مرض CLN6 في أغنام جنوب هامبشاير. تظهر الأغنام المصابة العديد من السمات السريرية والمرضية للمرض البشري ، بما في ذلك ضمور الشبكية وفقدان الرؤية10,11. على الرغم من أن العلاج الجيني CLN5 الموجه للدماغ في الأغنام المصابة بمرض CLN5 يمكن أن يمنع أو يوقف ضمور الدماغ والتدهور السريري ، إلا أن الأغنام المعالجة لا تزال تفقد رؤيتها9. وقد سلط ذلك الضوء على الحاجة إلى علاج شبكية العين للحفاظ على الرؤية والحفاظ على نوعية حياة أفضل ، مما أدى إلى إنشاء بروتوكول للعلاج الجيني للعين في الأغنام.
تمثل عين الأغنام نموذجا جيدا للعين البشرية نظرا لتشابهها في أبعاد كرة العين وحجم الجسم الزجاجي وبنية الشبكية10،12،13. تفصل هذه الورقة البروتوكول الجراحي لتوصيل IVT بحجم صغير (≤100 ميكرولتر) من الناقل الفيروسي العلاجي إلى عين الأغنام.

<table><tbody><tr><td>1 مل حقنة أمان منخفضة المساحة الميتة مع إبرة 0.5 بوصة متصلة بشكل دائم</td><td>فيشر العلمية ، أوكلاند ، نيوزيلندا</td><td>05-561-28</td><td>حقنة أمان Covidien Monoject Tuberculin أو أنبوب مماثل</td></tr><tr><td>للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل</td><td>أنابيب الأوتوكلاف Sigma Aldrich</td><td>HS4323</td><td>للتعقيم قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>آلة التخدير مع مقعد الغاز والشاشة & nbsp ؛</td><td>Hyvet Anesthesia, كرايستشيرش, نيوزيلندا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>قطرات العين بالمضادات الحيوية&nbsp;</td><td>تيفا فارما المحدودة ، أوكلاند ، نيوزيلندا</td><td></td><td>الاسم التجاري: Chlorafast (0.5٪ كلورامفينيكول)</td></tr> <tr><td>BrightMount بالإضافة إلى وسيط تركيب مضاد للبهتان</td><td>Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة</td><td>ab103748</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 & prime ؛ ، 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td> <td>Sigma Aldrich ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>مهدئ</td> <td>ديازيبامIlium ، Troy Laboratories Pty Ltd ، تاورانجا ، نيوزيلندا</td><td></td><td>5 مجم / مل</td></tr><tr><td>أنابيب القصبة الهوائية</td><td>Flexicare Medical Ltd ، ماونتن الرماد ، معيار المملكة المتحدة</td><td></td><td>، مكبل. الأحجام 7 أو 7.5 أو 8 حسب حجم الأغنام</td></tr><tr><td>منظار العين</td><td>الرؤوس الطبية المحدودة ، تاورانجا ، نيوزيلندا</td><td>KP151 / 14</td><td>Nopa Barraquer-Colibri (10 مم)</td></tr> <tr><td>الستارة الجراحية المصنوعة</td><td>من Amtech Medical Ltd ، Whanganui ، نيوزيلندا</td><td>DI583</td><td>أو ما شابه ذلك &nbsp ؛</td></tr><tr><td>نصائح التصفية</td><td>Interlab ، أوكلاند ، نيوزيلندا</td><td></td><td>10 و 200 و 1,000 & micro ؛ L&nbsp;</td></tr><tr><td>محلول الفورمالديهايد (37٪)</td><td>فيشر ساينتفيك ، أوكلاند ، نيوزيلندا</td><td>AJA809-2.5PL</td><td>اصنع ما يصل إلى 10٪ في الماء المقطر مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم</td></tr><tr><td>الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية</td> <td>&nbsp ؛ A-11012</td><td>استخدم عند تخفيف 1: 500</td></tr><tr><td>مخدر إيزوفلوران</td><td>Attane ، باير لصحة ، أوكلاند ، نيوزيلندا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الكيتامين هيدروكلوريد مخدر / مسكن</td><td>PhoenixPharm Distributors Ltd ، أوكلاند ، نيوزيلندا</td><td></td><td>100 مجم / مل</td></tr><tr><td>منظار الحنجرة (بيطري)</td> <td>KaWe Medical ، شفرة</td><td>Miller C الدنماركية</td><td></td> ، مقاس 2</tr><tr><td>إبر &nbsp ؛</td><td>Capes Medical Ltd ، تاورانجا ، نيوزيلندا</td><td>302025</td><td>BD تحت الجلد ، أو ما شابه ذلك</td></tr><tr>من <td>Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd غير</td><td>الستيرويدية المضادة للالتهابات</td> ، أوكلاند ، نيوزيلندا <td>49402/008</td><td>الاسم التجاري: Metacam 20 (20 مجم / مل meloxicam)</td></tr> <tr><td>ملقط غير مسنن</td><td>Capes Medical Ltd ، تاورانجا ، نيوزيلندا</td><td>AB864 / 16</td><td>أو ما شابه ذلك &nbsp ؛</td></tr>عدم <tr><td>الأسنان hemostat</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>AA150 / 12</td><td>أو ما شابه&nbsp;</td></tr><tr><td>مصل الماعز العادي</td><td>Thermo Fisher Scientific ، كرايستشيرش ، نيوزيلندا</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>الأكسجين (الطبي)</td> <td>BOC Gas ، كرايستشيرش ، نيوزيلندا</td><td></td><td>اسطوانة D2 ، رمز الغاز 180</td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات &nbsp ؛</td><td>ثيرمو فيشر العلمي ، كرايستشيرش ، نيوزيلندا</td><td>10010023</td> محلول بوفيدون اليود <td>المعقم والمفلتر</td></tr><tr><td></td><td>Capes Medical Ltd ، تاورانجا ، نيوزيلندا</td><td>005835</td><td>الاسم التجاري: البيتادين (10٪ بوفيدون اليود)</td></tr> <tr><td>الأرانب المضادة للبقرة البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP)</td> <td>داكو ، جلوستروب ، الدنمارك</td><td>Z0334</td><td>استخدم عند تخفيف 1: 2،500</td></tr><tr><td>النمط المصلي للفيروس المرتبط بالغدة التكميلي ذاتيا 9 ، الذي يحتوي على محفز عمل بيتا الدجاج (CBh) والعوض المحسن بالكودون CLN5</td><td>جامعة نورث كارولينا ناقلات كور ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية.</td><td>scAAV9 / CBh-oCLN5opt</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم 0.9٪ محلول IV</td><td>Capes Medical Ltd ، تاورانجا ، نيوزيلندا</td><td>AHB1322</td><td>الاسم التجاري: محلول ملحي &nbsp ؛</td></tr><tr><td>المضادات الحيوية تحت الجلد</td><td>Intervet Schering Plough Animal Health Ltd ، ويلينجتون ، نيوزيلندا</td><td></td><td>الاسم التجاري: Duplocillin LA (150،000 وحدة دولية / مل من البنسلين البروكايين و 115،000 وحدة دولية / مل البنسلين البنسلين)</td></tr> <tr><td>مقص منحني حاد حاد جراحي &nbsp ؛</td><td>الرؤوس الطبية المحدودة ، تاورانجا ، نيوزيلندا</td><td>SSSHBLC130</td><td></td></tr><tr><td>حقنة Terumo Luer Lock</td><td>Amtech Medical Ltd ، Whanganui ، نيوزيلندا</td><td>SH159 / SH160</td><td>محاقن معقمة ؛ 10 مل لرسم الأدوية الحثية ، 20 مل لرسم</td></tr><tr><td>مسحوق مطهر Virkon</td><td>الملحي EBOS Group Ltd ، كرايستشيرش ، نيوزيلندا</td><td>28461115</td><td></td></tr></tbody></table>

الحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام

Intravitreal Injections in the Ovine Eye

هناك عدة طرق لتوصيل العوامل العلاجية إلى شبكية العين ، بما في ذلك داخل الجسم الزجاجي (IVT) ، تحت الشبكية ، فوق المشيمية ، حول العين ، أو الإدارة الموضعية. يتضمن توصيل الدواء IVT حقنا في الخلط الزجاجي للعين ، وهي مادة هلامية تملأ الغرفة الخلفية للعين وتحافظ على شكل كرة العين. على الرغم من أن طريق IVT أقل استهدافا بشكل محدد من الولادة تحت الشبكية ، إلا أنه أقل توغلا ويستخدم على نطاق واسع في الإعدادات السريرية لمجموعة من أمراض العين. 
لقد أثبتنا سابقا فعالية التوصيل داخل الجسم الزجاجي لمنتج العلاج الجيني بوساطة الفيروس الغدي (AAV9). CLN5) في الأغنام مع شكل CLN5 يحدث بشكل طبيعي من داء الشحمي العصبي السيرويد (NCL). تلقت الأغنام المصابة العلاج الجيني IVT في عين واحدة ، مع العين الأخرى غير المعالجة بمثابة عنصر تحكم داخلي. تم الحفاظ على بنية الشبكية ووظيفتها في العين المعالجة لمدة تصل إلى 15 شهرا بعد العلاج ، في حين أظهرت العين غير المعالجة انخفاضا تدريجيا في الوظيفة وضمورا شديدا أثناء فحص ما بعد الوفاة. بناء على دراسات الأغنام ، تم مسح منتج العلاج الجيني CLN5 كدواء جديد تجريبي مرشح (IND) من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية في سبتمبر 2021. توضح هذه الورقة بالتفصيل البروتوكول الجراحي لتوصيل IVT لناقل فيروسي علاجي إلى عين الأغنام.

تم إثبات فعالية توصيل IVT لناقل العلاج الجيني CLN5 في تخفيف ضعف الشبكية وانحطاطها في الأغنام باستخدام CLN5 NCL من قبل مجموعة البحث15 هذه. تلقت الأغنام المصابة حقنة IVT واحدة 100 ميكرولتر من CLN5 معبأة في ناقل AAV من النمط المصلي 9 (AAV9) (AAV9. CLN5) في عين واحدة ، مع العين المقابلة بمثابة عنصر تحكم داخلي غير معالج. تم تقييم الرؤية شهريا من العمر عند الحقن (3 أشهر) إلى المرحلة النهائية من المرض (18 شهرا). تم إجراء تحليل ما بعد الوفاة لأنسجة الشبكية على العيون المعالجة وغير المعالجة ، بالإضافة إلى ...

تم إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام بهدف تقديم العلاج الجيني بوساطة فيروسية إلى شبكية العين.

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or ...

يمكن استخدام الحقن داخل الجسم الزجاجي لتوصيل العوامل العلاجية إلى شبكية العين. يتم تقديم بروتوكول للحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام ، كنموذج للعين البشرية ، هنا. الحقن داخل الجسم الزجاجي أقل توغلا بكثير من الحقن العينية الأخرى.يمكن استخدام الحقن داخل الجسم الزجاجي بنجاح لتقديم منتج علاج جيني وعلاج تنكس الشبكية في الأغنام باستخدام ليبوفوسينوز سيرويد عصبي طبيعي. بمجرد تخدير الأغنام ، ابدأ في تطهير العين المراد حقنها عن طريق ريها بمحلول اليود البوفيدون بنسبة 1 إلى 5٪ باستخدام حقنة سعة 20 ملليلتر. ثم ضع ستارة جراحية معقمة ومغطاة على العين.ضع منظار العين على الجفون لإبقاء العين مفتوحة. أمسك الملتحمة البصلية على الجانب الجانبي الظهري للعين بالملقط وقم بتدوير كرة العين بطنيا. أدخل الإبرة حوالي سبعة ملليمترات خلف الصلبة على الجانب الجانبي للعين ، وزاوية خلفية لتجنب العدسة.تطبيق حقنة واحدة من 100 ميكرولتر كبلعة، بالقرب من شبكية العين قدر الإمكان، دون الإخلال بسطح الشبكية. شطف العين مع ما يقرب من 10 إلى 15 ملليلتر من 1 إلى 5٪ محلول اليود بوفيدون تليها 10 ملليلتر من المياه المالحة، قبل إزالة المنظار والستارة. أظهر تحليل تخطيط كهربية الشبكية الحفاظ على وظيفة الشبكية في العين المعالجة بينما انخفضت العين غير المعالجة بطريقة مماثلة للحيوانات المصابة ب CLN5.كانت أنسجة الشبكية شبه طبيعية في العين المعالجة بسمك شبكي إجمالي يمكن مقارنته بالحيوانات الضابطة السليمة في الشبكية المركزية. في المقابل ، كان سمك شبكية العين غير المعالجة مشابها للحيوانات المصابة ب CLN5. كان التعبير عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي ، أو GFAP ، وهو علامة على إجهاد الشبكية والخلايا النجمية ، أقل في العيون المعالجة من العيون غير المعالجة ، مما يشير إلى أن الالتهاب المرتبط بالمرض قد تم تخفيفه بعد العلاج.مع وضع بروتوكول للحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام ، يمكن الآن استخدام الأغنام لاختبار سلامة وفعالية العديد من العوامل العلاجية التي يتم توصيلها داخل الجسم الزجاجي.

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

حقن Intravitreous هو التقنية المستخدمة على نطاق واسع في بحوث العلوم البصرية لأمراض العين أو التطبيق المباشر للعلاج المحلية. أثبت هذا الفيديو على بروتوكول للحقن intravitreous باستخدام المحاقن 1ml مع ماصة الزجاج. يتم إعطاء نصائح مفيدة حول تجنب نزيف حاد وتلف العدسة.

Intravitreous حقن لأمراض العين تأسيس النموذجي

المصدر: Park, S. W., et al. النهج الحزوي - الحقن تحت الشبكية للنواقل الفيروسية للعلاج الجيني في الفئران صبغة الشبكية الظهارية. J. Vis. Exp. (2015)يصف الفيديو طريقة الحقن تحت الشبكية للنواقل الفيروسية في ظهارة صبغة الشبكية (RPE) في نموذج الفأر. يفصل الإجراء من التخدير وإعداد العين إلى التوصيل الدقيق لنواقل الفيروسات ، مما يضمن تكامل الجينات والتعبير عنها في RPE.

الحقن تحت الشبكية للنواقل الفيروسية في ظهارة صبغة الشبكية في نموذج الفأر

تستخدم الأرانب على نطاق واسع لدراسة الحرائك الدوائية للأدوية داخل العين. نصف طريقة لإجراء دراسات الحرائك الدوائية للأدوية داخل العين باستخدام عيون الأرانب.

استخدام الأرنب عيون في دراسات حركية الدواء من داخل بصري المخدرات

هنا نظهر نهجاً جديداً لاستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي عالية الدقة (الموارد البشرية-التنمية المستدامة-أكتوبر) لمساعدة إيصال وكلاء العلاج الجيني في الفضاء سوبريتينال وتقييم تغطية مساحية وتميز حيوية مستقبله.

القرار أولتراهيغ الماوس الضوئية التماسك التصوير المقطعي لمساعدة الحقن داخل مقلة العين في أبحاث العلاج الجيني الشبكية

يمكن أن تكون الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية كعلاج استبدال خلية لشكل متقدمة من الجفاف المرتبطة بالسن البقعي. ويصف هذا البروتوكول توليد نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية وزرع الخلايا الظهارية الإنسان صبغة الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية سوبريتينال إلى هذا النموذج من المرض.

سوبريتينال زرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية

نحن نصف هنا طريقة الحقن داخل في الواقع والكمية البكتيرية اللاحقة في نموذج الماوس من التهاب بطانة الرحم البكتيرية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لقياس الاستجابات المناعية المضيفة والبكتيرية والمضيفة الجينات التعبير.

الحقن داخل القلبية وكمية من المعلمات العدوى في نموذج الماوس من التهاب Endophthalmitis البكتيرية

في هذه المخطوطة، يتم توضيح الحقن تحت الملتحمة كطريقة صالحة لتوصيل النواقل لأنسجة العين في الفئران باستخدام نظام حقن يتكون من مضخة حقنة تسريب/سحب وحقنة قابلة للإزالة محكمة الإغلاق مقترنة بإبر الحقن المجهري. نظام الحقن هذا قابل للتكيف أيضا مع طرق إدارة العين الأخرى.

الإعطاء تحت الملتحمة لنواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة في نماذج الحيوانات الصغيرة

يصف هذا البروتوكول تقنية للحقن داخل الكاميرا في الفئران باستخدام شق مركزي في القرنية ونفق طويل في الغرفة الأمامية. تقلل طريقة الحقن هذه من خطر إحداث تلف غير مقصود للأنسجة وبالتالي تحسن الدقة والتكاثر.

الحقن داخل الكاميرا في الفئران ذات المخاطر المنخفضة للآثار الضارة

يصف هذا البروتوكول تقنية فريدة باستخدام نهج عبر الملتحمة للوصول إلى العصب البصري للفئران للحقن.

نهج عبر الملتحمة للحقن في العصب البصري للفئران

تقدم هذه الدراسة منهجية لتوصيل العلاجات إلى شبكية العين والأعصاب البصرية للفئران البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة فريدة لاسترجاع الأنسجة لمجموعة من أعلى إلى أسفل من العصب البصري وشبكية العين في الفئران البالغة.

التوصيل العلاجي للعين واسترجاع الأنسجة المتقدم في الفئران البالغة

تعلم بروتوكول الحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام كنموذج للعين البشرية. تُستخدم هذه الطريقة لتوصيل العلاج الجيني لعلاج التنكس الشبكي بطريقة أقل توغلاً.

الحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام

استكشف المزيد من الفيديوهات