تحفيز إنقاذ الاورام الحميدة في مستعمرات الشعاب المرجانية للحصول على الإكثار الدقيق الفردي للاستخدام التجريبي المختبري

لا يزال التكاثر الدقيق المرجاني في مهده. يعد تحسين بروتوكولات إنقاذ الاورام الحميدة أمرا أساسيا لسد هذه الفجوة مما يسمح للعلماء باستخدام الاورام الحميدة كنماذج لدراسة الشعاب المرجانية في بيئات المختبرات. يجعل إنقاذ الاورام الحميدة من الممكن إنشاء العديد من الانتشار من شظايا المرجان الصغيرة.

يمكن استخدام الاورام الحميدة في تجارب مختلفة تسهل مراقبة العمليات المجهرية في الشعاب المرجانية ، على سبيل المثال. الشعاب المرجانية مهددة. هدفنا هو استخدام هذا النموذج القابل للتكرار لتطوير استراتيجيات لحماية الشعاب المرجانية من التبييض والتهديدات البيئية الأخرى بطريقة فعالة وغير جراحية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحقيق في فسيولوجيا المرجان وتفاعلات الميكروبيوم المضيف والآليات التي ينطوي عليها التبييض. مثل هذه النتائج يمكن أن تسهم في تحسين البروبيوتيك المرجاني ، على سبيل المثال. استخدام مياه البحر مع الملوحة الكافية هو المفتاح.

يجب أن تبدأ الملوحة على مستوى البيئة الطبيعية للشعاب المرجانية وتزداد ببطء حتى لا يكون الإجهاد ضارا بشكل مفرط. جمع الاورام الحميدة في اللحظة الصحيحة واختيار تلك التي هي الأكثر سلامة أمر بالغ الأهمية لبقائها. يمكن أن يكون العرض المرئي أمرا حيويا لفهم هذه الإشارات.

أولا ، استخدم كماشة القطع القطرية لقطع شظايا صغيرة من مستعمرة مرجانية ، ثم ضعها في أطباق بتري صغيرة مليئة ب 12 ملليلتر من مياه البحر التي تأقلمت معها مستعمرة المرجان. اترك الطبق مفتوحا لمدة 24 ساعة تقريبا في درجة الحرارة المحيطة بحيث يتبخر الماء وتزداد ملوحته تدريجيا. عندما يمكن ملاحظة هضم الأنسجة بين الاورام الحميدة ، استخدم ماصة نقل 1 ملليلتر لإنشاء تدفق لطيف بالقرب من الأنسجة المرجانية.

سيساعد التدفق ببطء على إكمال انفصال الاورام الحميدة التي هضمت بالفعل الأنسجة المحيطة بها من الهيكل العظمي ، ثم مع الماصة ، تبادل الماء ببطء في طبق بتري بالماء متساوي السموت. لإعداد مياه البحر عالية الملوحة ، خذ مياه البحر العادية وأضف كلوريد الصوديوم إلى مياه البحر لإعداد ثلاثة لترات من مياه البحر عالية الملوحة حتى تزداد الملوحة بنسبة 85٪ بعد قطع شظايا صغيرة من المرجان كما هو موضح سابقا ، ضعها في وعاء سعة 10 لترات مع ثلاثة لترات من مياه البحر متساوي السمنة متصل بمضخة تمعجية. املأ هذه الحاوية بثلاثة لترات من مياه البحر عالية الملوحة المعدة مسبقا لمدة 24 ساعة بمعدل 126 ملليلتر في الساعة لزيادة الملوحة بنحو 40٪ باستخدام ماصة ، قم بإنشاء تدفق لطيف للمياه لإطلاق الاورام الحميدة من الهيكل العظمي.

تبادل المياه ببطء في الحاوية مع مياه البحر متساوي السمنة. أضف 26.29 جراما من كلوريد الصوديوم ، و 0.872 جراما من كلوريد البوتاسيوم ، و 2.16 جراما من كبريتات المغنيسيوم ، و 11.94 جراما من كلوريد المغنيسيوم ، و 3.42 جراما من كبريتات الصوديوم ، و 0.26 جراما من بيكربونات الصوديوم إلى لتر واحد من الماء منزوع الأيونات لإعداد مياه البحر الخالية من الكالسيوم ، ثم املأ أطباق بتري بمياه البحر الخالية من الكالسيوم. بعد قطع شظايا المرجان الصغيرة ، غمرها في مياه البحر الخالية من الكالسيوم في أطباق بتري.

ضع الأطباق في حاضنة مدارية لمدة ثلاث ساعات بسرعة دوران تبلغ 80 دورة في الدقيقة ، ثم انقل الشظايا إلى أطباق بتري مملوءة ب 20٪ DMEM محضرة بمياه البحر الاصطناعية المكونة من 40 وحدة ملوحة عملية وتحتوي على 100 ملليغرام لكل لتر من الأمبيسلين. احتضان الشظايا عند 26 درجة مئوية و 80 دورة في الدقيقة. تبادل الوسائط كل يوم حتى يمكن ملاحظة هضم الأنسجة بين الاورام الحميدة وتبدأ الاورام الحميدة الفردية في الانفصال عن الهيكل العظمي ، ثم تنقل الاورام الحميدة إلى مياه البحر المعقمة وتحضنها لمدة ساعة واحدة.

بمجرد عودة الاورام الحميدة إلى مياه البحر المصفاة ذات الملوحة غير المجهدة ، حدد الاورام الحميدة القابلة للحياة من خلال مراقبة سلامة الأنسجة وحركتها الناجمة عن التدفق الهدبي تحت المجهر الاستريو. ضع الاورام الحميدة المختارة في طبق بتري وقم بتغطية طبق بتري بشبكة عوالق بحجم شبكة 200 ميكرومتر حتى لا تطفو الاورام الحميدة بعيدا عن الطبق. ضع طبق بتري داخل حوض السمك مع الظروف المناسبة لأنواع الشعاب المرجانية المستخدمة.

لمنع فرط نمو الطحالب ، افتح طبق بتري مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لتجديد الماء وتنظيف الطبق. بعد اختيار الاورام الحميدة كما هو موضح سابقا ، باستخدام ماصة نقل ، ضعها في قارورة خلية سطحية مساحتها 75 سنتيمترا مربعا مملوءة ب 50 ملليلتر من مياه البحر متساوي السموتيك ، ثم أغلق القارورة وضعها في حاضنة مضبوطة في دورات ضوئية مدتها 12 ساعة ، 26 درجة مئوية و 40 دورة في الدقيقة. إذا امتلأت القارورة بالطحالب أو الأغشية الحيوية ، فانقل محتوياتها إلى قارورة نظيفة.

في هذه الدراسة ، تم تحفيز إنقاذ الاورام الحميدة بثلاث طرق مختلفة. أدت طريقة تبخر المياه إلى إنقاذ كامل في غضون 24 ساعة من الحضانة ، وزادت الملوحة من 40 إلى 59 وحدة ملوحة عملية بعد 24 ساعة. كما أدت طريقة إمدادات المياه المالحة إلى إنقاذ الاورام الحميدة بعد 24 ساعة من الحضانة.

وهنا زادت الملوحة من 40 إلى 52 وحدة ملوحة عملية بعد 12 ساعة من الحضانة، ثم إلى 59 وحدة ملوحة عملية بعد 24 ساعة. اكتمل تحريض الإنقاذ من خلال الحضانة في مياه البحر الخالية من الكالسيوم بعد ثلاث ساعات من حضانة الاورام الحميدة فيها ، تليها 20 ساعة من الحضانة في وسائط DMEM 20٪ ، في جميع الطرق الثلاث ، يمكن توليد الاورام الحميدة المرجانية الفردية. يمكن للأورام الحميدة المرجانية الناتجة عن طريقة التبخر البقاء على قيد الحياة لمدة ستة أسابيع ، في حين أن تلك التي تنتجها طريقة إمدادات مياه البحر عالية الملوحة يمكن أن تعيش لمدة ثمانية أسابيع في أطباق بتري داخل أحواض السمك.

الاورام الحميدة التي تم الحصول عليها من طريقة تبخر مياه البحر المحفوظة في قوارير زراعة الخلايا داخل الحاضنات بقيت لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع دون تفكك كامل لأنسجتها. عند فصل الاورام الحميدة عن الهيكل العظمي ، من المهم أن تكون لطيفا. إذا لم يتم فصلها تماما ، فإن إجبار الانفصال عن طريق سحب المياه بقوة سيؤدي إلى تلف وانخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة.

باستخدام هذه الطرق ، يمكن تحفيز تسوية الاورام الحميدة. يمكن أن تجيب تسوية الاورام الحميدة على أسئلة حول عمليات التكلس والنمو. بعد تطوير تحريض إنقاذ الاورام الحميدة ، تمكن الباحثون من دراسة التكوين الأولي للهيكل العظمي المرجاني وتصور ابيضاض المرجان مباشرة في مقياس الاورام الحميدة.