التقنيات الجزيئية والمناعية في نموذج فأر مهندس وراثيا لورم الجهاز الهضمي اللثوي

يصف بروتوكولنا تربية وصيانة وتشريح ومعالجة العينات لنموذج الماوس الوحيد المختص بالمناعة ، GIST ، المستخدم حاليا. نأمل أن يتمكن الباحثون في المستقبل من استخدام نموذج الماوس هذا من أجل إجراء مزيد من الأبحاث الانتقالية في GIST. تتضمن العلاجات التقليدية في GIST العلاج الجزيئي المستهدف بمثبطات التيروزين كيناز.

يمكن هذا النموذج الباحثين من اختبار العلاجات المناعية في GIST. للبدء ، قم بتعقيم جميع الأدوات ، وارتداء القفازات طوال الإجراء ، والحفاظ على حقل معقم. تحضير منطقة شق مع 70 ٪ من الإيثانول.

باستخدام المقص ، قم بعمل شق عمودي في خط الوسط بطول سنتيمترين وأدخل تجويف البطن. قم بتحليل أي التصاقات داخل البطن بشكل حاد. لإزالة العقدة الليمفاوية المساريقية المستنزفة ، حدد الأعور وارفع مساريقه بشكل فائق.

في منتصف الطريق تقريبا إلى قاعدة المساريق القولون ، حدد العقدة الليمفاوية المساريقية وتشريحها بحدة. حسب الحاجة ، قسم أنسجة العقدة الليمفاوية إلى أثلاثين لعزل البروتين والأنسجة وتعليق الخلية الواحدة. ضع أنسجة العقدة الليمفاوية في 20 ملليلتر من وسط RPMI لتعليق خلية واحدة والحفاظ على الجليد.

يتم استبدال الأعور في الغالب ب GIST في الفئران Kit558. لعزل GIST والأعور ، قم بتقسيم التقاطع اللفائفي بعناية من قاعدة الورم. ثم ، قسم الأعور مرة أخرى ، سنتيمترين بعيدين إلى قاعدة الورم.

في 50 إلى 60٪ من الفئران Kit558 ، يحتوي رأس الورم على غطاء من الأنسجة الدائرية ، والتي تحتوي عادة على سائل مصلي ، ولكن نادرا ما تحتوي على القيح. تشريح أنسجة الغطاء بشكل حاد بعيدا عن أنسجة الورم. قسم أنسجة الورم والأعور إلى أثلاثين لعزل البروتين والأنسجة وتعليق الخلية الواحدة.

بالنسبة للمعلقات أحادية الخلية ، ضع أنسجة الورم أو الأعور في HBSS مع 2٪ FCS ، وهو ما يكفي لتغطية العينة ، والحفاظ على الجليد. صب وسائط RPMI مع عينة العقدة الليمفاوية على مرشح 100 ميكرومتر. انقل الفلتر إلى مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر، وقم بهرس العقدة الليمفاوية بالطرف الناعم لمحقنة بلاستيكية سعة 3 ملليلترات.

اغسل الفلتر ب 20 ملليلتر من وسائط RPMI. الطرد المركزي للعينات وشفط السوبرناتان. أعد تعليق الكريات في 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للخرز واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر.

جمع ترشيح الخلية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. الطرد المركزي للعينات والتخلص من supernatant.

ثم ، أعد التعليق في المخزن المؤقت للخرزة لقياس التدفق الخلوي. قم بإعداد مخزن كولاجيناز مؤقت كما هو موضح في مخطوطة النص. ضع GIST في طبق معقم وأضف 2.5 ملليلتر من الكولاجيناز العازل.

باستخدام مشرط ومقص معقمين ، قم بفرم الورم حتى يصبح في شظايا دقيقة. استخدم ماصة كبيرة التجويف لشفط الورم والكولاجيناز في أنبوب سعة 50 ملليلتر. احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بمعدل 100 دورة في الدقيقة ، ثم قم بإخماد التفاعل بملليلتر من FBS.

صب الكولاجيناز مع عينة GIST على مرشح 100 ميكرومتر وهرس الورم مع نهاية ناعمة من حقنة بلاستيكية ثلاثة ملليلتر وجمعها في أنبوب 50 ملليلتر. اغسل الفلتر ب 20 ملليلتر من HBSS. قم بالطرد المركزي للترشيح عند 450 RCF لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم تخلص من السوبرناتال.

أعد تعليق الكريات في 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للخرز واسكبه فوق مرشح 40 ميكرومتر اجمع خلايا الترشيح والعد باستخدام مقياس الدم. جهاز طرد مركزي وشفط السوبرنات ، ثم إعادة التعليق في المخزن المؤقت للخرز لقياس التدفق الخلوي. باستخدام المقص ، قم بتقسيم الأعور طوليا لفضح الغشاء المخاطي الداخلي.

قطعها إلى أقسام 0.5 سم وضعها في أنبوب 50 ملليلتر مع خمسة ملليلتر من HBSS و 2٪ FBS. رج بقوة لمدة 30 ثانية وجهاز طرد مركزي على 450 RCF لمدة 20 ثانية. ثم ، تجاهل supernatant.

أضف من خمسة إلى 20 ملليلتر من HBSS مع EDTA ثنائي المليمولار. احتضنه عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي وتخلص من السوبرنات ، ثم أعد تعليق الكريات في خمسة إلى 20 ملليلتر من HBSS.

رج الخليط بقوة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بجهاز الطرد المركزي عند 450 RCF لمدة 20 ثانية وتخلص من supernatant. كرر هذه العملية مرة أخرى. أعد تعليق الكريات في خمسة ملليلترات من الكولاجيناز العازل ، ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عند 100 دورة في الدقيقة.

رجه بقوة كل 10 دقائق وقم بإخماد التفاعل باستخدام ملليلترين من FBS. صب الكولاجيناز مع عينة الأعور على مرشح 100 ميكرومتر وهرس مع نهاية ناعمة من حقنة بلاستيكية ثلاثة ملليلتر. اغسل الفلتر ب 20 ملليلتر من HBSS وجمع الترشيح.

جهاز الطرد المركزي والتخلص من supernatant. أعد تعليق الكريات في 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للخرز واسكبها على مرشح 40 ميكرومتر. جمع الخلايا المرشحة وعدها باستخدام مقياس الدم.

كرر عملية الطرد المركزي مرة أخرى وأعد تعليق الكريات في المخزن المؤقت للخرز لقياس التدفق الخلوي. كان متوسط عمر الفئران Kit558 ثمانية أشهر بسبب انسداد الأمعاء التدريجي. عبرت الأورام من الفئران Kit558 عن العلامات الأساسية ل GIST ، بما في ذلك مجموعة التيروزين كيناز ، والقناة عبر الغشاء Dog1 ، وعامل النسخ ETV1.

تمت دراسة الأورام بحثا عن تغييرات في مسار إشارات KIT مثل علامات المصب ERK و AKT أو البيئة الدقيقة المناعية ، والتي تحاكي عن كثب GIST البشري. تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب لتتبع حجم الورم كقياس دقيق لاستجابة الورم. يعد تشريح الورم بعيدا عن التقاطع اللفائفي وبعيدا عن غطاء الساق أمرا مهما لالتقاط وزن الورم الحقيقي والتحليل المناعي والجزيئي.

داخل GIST ، سمح هذا النموذج بالتحقيق في البيئة الدقيقة للورم ، وكذلك العلاجات المناعية.