تنقية ومراقبة جودة معقدات السيبتين المؤتلفة لإعادة التكوين الخالي من الخلايا

هذا البروتوكول يجعل من الممكن تنقية مجمعات السيبتين عالية الجودة ، وهذا ضروري لدراسة الأدوار العديدة للسبتين في الخلية. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي توليف إجراء بسيط لتنقية السيبتين عالي الجودة باستخدام بلازميدات Addgene. يصعب دراسة السيبتين في الخلايا بسبب تفاعلاتها العديدة.

تساعدنا إعادة تكوين الكبريت على فصل هذا التعقيد من خلال دراستها في نظام بسيط. نوصي بإجراء تنقية في يوم واحد لمنع التدهور. في تجربتنا ، سيؤدي ذلك إلى زيادة عمر وجودة البروتين.

للبدء ، قم بتنمية الثقافة البكتيرية المحولة عند 37 درجة مئوية في حاضنة شاكر حتى تصل الكثافة البصرية عند طول موجي يبلغ 600 نانومتر إلى اثنين إلى ثلاثة للسبتين غير المسمى ، أو 0.6 إلى 0.8 ل msfGFP أو mEGFP المسمى septins. بعد الحضانة ، قم بتحفيز تعبير البروتين عن طريق إضافة IPTG إلى تركيز نهائي قدره 0.5 مليمولار واحتضان الخلايا التي تعبر عن أوليغومرات السيبتين غير المصنفة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ، أو الخلايا التي تعبر عن msfGFP المسمى oligomers غير المتجانسة عند 17 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ثم بيليه الخلايا في 4،000 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية وقم بإذابة الحبيبات في 100 ملليلتر من محلول التحلل لتحلل الخلايا. بعد ذلك ، استخدم صوتي طرف بسعة 30٪ لصوتنة الخلية. توضيح خلية المحللة عن طريق الطرد المركزي في 20،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وحفظ طاف.

اختياريا ، خذ عينة لتغيير طبيعة الكهربائي كما هو موضح في المخطوطة. للحصول على كروماتوغرافيا تقارب للسبتين الموسومة به ، قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا النيكل عالي الأداء المعبأ مسبقا مع جميع المخازن المؤقتة المطلوبة. قم بتحميل المادة الطافية الموضحة وصولا إلى العمود وابدأ نظام الكروماتوغرافيا.

ثم قم بالتخلص من مجمعات السيبتين باستخدام محلول شطف HisTrap بنسبة 50٪ بمعدل تدفق يبلغ ملليلتر واحد في الدقيقة. للحصول على تركيز إيميدازول من 250 مليمولار ، وجمع الكسور 0.5 ملليلتر. الآن راقب الامتصاص البصري للشطف عند 280 نانومتر باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع واختر الكسور التي تحتوي على مجمعات السيبتين.

بالنسبة لكروماتوغرافيا التقارب للبروتينات الموسومة Strep-II ، قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا StrepTactin sepharose عالي الأداء معبأ مسبقا مع عازلة septin. قم بتحميل السيبتين الذي يحتوي على الكسور المستردة من عمود النيكل بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة وابدأ نظام الكروماتوغرافيا. ثم اغسل البروتين المرتبط وقم بتخفيف مجمعات السيبتين باستخدام محلول شطف StrepTrap بنسبة 100٪ بمعدل تدفق يبلغ ملليلتر واحد في الدقيقة.

للحصول على تركيز 2.5 مليمولار ديسثيوبيوتين ، اجمع 0.5 ملليلتر من الكسور. اختر الكسور التي تحتوي على معقدات السيبتين كما هو موضح بالامتصاص البصري للشطف عند 280 نانومتر يتم رصدها عبر الإنترنت باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع. بعد إزالة ديسثيوبيوتين عن طريق غسيل الكلى ، قم بتجميع مجمعات البروتين إلى حجم القسمة المطلوب ، وقم بتجميد القسمة ، وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

بالنسبة للفحص المجهري للتشتت التداخلي ، اغسل الشرائح الزجاجية رقم 1.5 عن طريق صوتنها في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق في الماء ، الأيزوبروبانول ، ومرة أخرى في الماء منزوع الأيونات. جفف شريحتين زجاجيتين بتيار لطيف من غاز النيتروجين. ثم ضع قطرة سبعة ميكرولتر من محلول Poly-L-Lysine بنسبة 0.01٪ في وسط إحدى الشرائح وضع مركز الشريحة الأخرى أعلى قطرة Poly-L-Lysine ، مع توجيه الشريحتين بشكل متعامد لسهولة الفصل.

بعد الحضانة لمدة 30 ثانية ، اغسل الشريحة عن طريق غمرها في دورق يحتوي على ماء منزوع الأيونات مرة واحدة وتطبيق تيار من الماء مباشرة مرتين. قم بتجفيفها بتدفق غاز النيتروجين ويمكن تخزين هذه الشرائح لمدة ستة أسابيع تقريبا في درجة حرارة الغرفة في الظروف الجافة. قبل التجربة ، قم بقص قطعة من اثنين في اثنين ، أو ثلاثة في اثنين ، أو ثلاثة في ثلاثة حشيات وألصقها على الجزء المعالج من Poly-L-Lysine من شريحة زجاجية ، وتجنب الشريحة الزجاجية والحشيات التي تلامس أي سطح متسخ عن طريق وضع الشريحة على مناديل ممسحة خفيفة.

الآن اضغط على الحشيات بطرف ماصة لإلصاقها بالبلاستيك الواقي الموجود على الحشيات. بعد ذلك ، قم بتسخين المخزن المؤقت للحاجز إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإذابة البروتينات في متناول اليد واحتفظ بها على الجليد بعد ذلك.

ثم ضع الشريحة مع حشيات على نظام القياس الضوئي للكتلة التجارية التي تحتوي على 19 ميكرولتر من المخزن المؤقت septin وقم بتركيز المجهر باستخدام خيار التركيز التلقائي. أعد التركيز باستخدام الإعدادات الجديدة ، باستخدام خيار التركيز البؤري التلقائي. لإنشاء مجلد مشروع، انقر فوق ملف متبوعا بمشروع جديد، ولتحميل مجلد مشروع لتخزين البيانات، انقر فوق ملف متبوعا بتحميل مشروع.

ثم ماصة ميكرولتر واحد من العينة إلى 19 ميكرولتر من قطرة الحاجز المؤقت. امزج ، وأثناء الخلط ، تجنب لمس أي شيء لمنع حركة الشريحة. ثم قم بتسجيل مقطع فيديو بإطار 6،000 بالنقر فوق تسجيل.

قم بتحليل مقاطع الفيديو باستخدام برنامج الشركة المصنعة للحصول على توزيع كتلة البروتين. إذا تداخلت قمم أحجام مختلفة من السيبتين غير المتجانسة كثيرا أو تم اكتشاف الكثير من الأحداث ، فقم بتقليل تركيز السيبتين النهائي وقياسه مرة أخرى. وعندما لا يتم قياس عدد كاف من الجزيئات المفردة ، قم بزيادة تركيز السيبتين والقياس مرة أخرى.

لتحليل السيبتين ، قم بإعداد 5X darkSPB ومزيج سيبتين يتكون من 100٪ سيبتين داكن بتركيز أعلى بست مرات من التركيز النهائي المطلوب في محلول السيبتين وواحد مليمولار ديثيوثريتول. ثم بلمرة السيبتين عن طريق خلط الماء ، 20٪ 5X darkSPB و 16.67٪ مزيج سيبتين ، بهذا الترتيب المحدد ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من العينة إلى شبكة مجهرية إلكترونية متوهجة مفرغة واحتضانها لمدة دقيقة واحدة.

الآن ، اغسل الشبكة مرتين عن طريق إضافة قطرة من المخزن المؤقت darkSPB وامتصاص السائل بورق ترشيح. يغسل مرة واحدة بالماء ويحتضن لمدة 30 ثانية مع 2٪ أسيتات اليورانيل. بعد ذلك ، امسح البقعة وجفف العينة في الهواء لبضع دقائق.

ثم تخيل حزم septin عند 120 كيلوفولت والتكبير بين 5،000X و 60،000X مع إلغاء التركيز من واحد إلى اثنين ميكرومتر. أظهر كروماتوجرام HisTrap و StrepTrap أن الجزء المجمع ذهب من بداية ذروة الشطف حتى استقر الامتصاص عند حوالي 250 ملليلتر و 50 ملليلتر على التوالي. أظهرت عصابات السيبتين شدة مماثلة في تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي الهلامي ، مما يشير إلى أن السيبتين سليمة.

في الرحلان الكهربائي الأصلي ، لوحظ النطاق الرئيسي المقابل ل oligomers غير المتجانسة السليمة ونطاق ثانوي يتوافق مع التشذيب أو tetramers. لا يمكن تمييز الوزن الجزيئي الظاهر للمجمعات الموسومة msfGFP عن تلك الخاصة بالمجمعات غير الموسومة. كشف القياس الضوئي الشامل عن أوكتامات سليمة وسداسي من السيبتين.

أشارت ذروة إضافية عند 241 كيلو دالتون إلى وجود بروتينين من الفول السوداني ، DSep1 و mEGFP-DSep2. أظهرت صور المجهر الإلكتروني النافذ لمجمعات السيبتين قضبان من السداسيات والأخطفات. تظهر علامات msfGFP ككثافات غامضة على الطرفين في octamers_9i1 سيبتين البشري 2 msfGFP.

يمكن ملاحظة مجموعات صغيرة من البروتينات في حقل TIRF الضحل. كشف الفحص المجهري متحد البؤر عن مجموعات كبيرة من الهياكل الخيطية العائمة. أظهر المجهر الإلكتروني النافذ حزم سيبتين صغيرة وكبيرة تتوافق مع العناقيد التي لاحظها المجهر الفلوري الانعكاسي الداخلي الكلي والمجهر متحد البؤر.

نوصي بالعمل على الجليد في جميع الأوقات أثناء عمليات التنقية وإضافة كواشف جديدة نحددها في البروتوكول. نحن مهتمون بتفاعلات السيبتين في سياق التحريك الخلوي. قمنا بإعادة تشكيل السيبتين مع الأغشية الحديثة الأكتين والأنابيب الدقيقة لدراستها بالفحص المجهري والعديد من المقايسات الفيزيائية الحيوية.

نستخدم السيبتين المنقى لدراسة كيفية تفاعل السيبتين مع خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة والليبيدات. ونستخدم أيضا الحاجز المنقى لبناء خلايا اصطناعية حيث تسهل الحاجز الانقسام الخلوي.