ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المؤلفون ممتنون لجريج سبرينجستين وناتاشا بول وتشارلز أوليا جونيور وجوناثان شيبانسكي وكاترينا تجونج على المناقشات المفيدة حول أفضل الممارسات لتفاعلات الفسفرة الثلاثية الكيميائية ولجيرالد جويس على التعليقات المفيدة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة MCB 2114588 من المؤسسة الوطنية للعلوم.

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.

إجراء الفسفرة الثلاثية الموصوف هنا متوافق على نطاق واسع مع تخليق أوليغونوكليوتيد باستخدام كيمياء الفوسفوراميديت القياسية. يجب أن تحتوي الفوسفوراميدات النيوكليوزيدية على مجموعات حماية أساسية متوافقة مع إزالة الحماية السريعة في AMA39 ، بما في ذلك مجموعات β-cyanoethyl القياسية على الفوسفيت ، والأيزوبوتيريل ، أو ثنائي ميثيل فورماميديل ، أو الأسيتيل ، أو فينوكسي أسيتيل ، أو 4-isopropylphenoxyacetyl على الأمينات الخارجية الحلقية للقواعد النووية. يجب حماية مجموعات الريبوز 2'-هيدروكسيل بواسطة مجموعات حماية سيليل ، إما t-butyldimethylsilyl (TBDMS) أو tri-iso-propylsilyloxymethyl (TOM) 40,41. كما تم الإبلاغ عن أن مجموعة pivaloyloxymethyl (PivOM) ذات الأساس الشفوي متوافقة مع الفسفرة الثلاثية الكيميائية30.
تم وصف طرق متعددة للفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات قليلة النوكليوتيدات الاصطناعية28،29،30،31،32،33،34،35. لقد وجدنا أن الفسفرة الثلاثية باستخدام كاشف Ludwig-Eckstein37 هي واحدة من أكثر الكواشف التي يمكن الوصول إليها ، ولا تتطلب أي توليف متخصص للكواشف ولا معدات متخصصة. تم استخدام Oligonucleotide 5′-triphosphates المحضر بهذه الطريقة بشكل روتيني كركائز لريبوزيمات RNA ligase ، بما في ذلك استخدام ثلاثي فوسفات L-RNA oligonucleotide ثلاثي الفوسفات الذي يتعذر الوصول إليه إنزيميا لتحقيق التوليف المعتمد على القالب وتكرار هذا الحمض النووي "الصورة المرآة"14,16,17,18 . هذه الطريقة مناسبة أيضا لإعداد الحمض النووي الريبي الصغير ذو الحلقة الجذعية 5 ′ ثلاثي الفوسفوريلات التي تعد منشطات قوية للاستجابة المناعية الفطرية في الفقاريات 6,7.
كاشف لودفيغ-إيكشتاين ، ساليسيل فوسفوروكلوريديت37 ، يتفاعل بشكل كبير مع الماء ، ويزيل بشكل فعال أي ماء يتم إدخاله عند إذابة الكاشف قبل تحميله على عمود أوليغونوكليوتيد. بعد هذه النقطة ، ومع ذلك ، فإن oligonucleotide 5 ′ الفوسفيتيل سوف يتفاعل بشكل تفضيلي مع أي ماء يتم إدخاله في النظام على pyrophosphate ، مما يشكل منتجا جانبيا 5′-H-phosphonate بعد العمل28,37,38. يضمن التحضير الدقيق لكواشف الفسفرة الثلاثية وغرفة تفاعل الفسفرة الثلاثية عدم تكوين هذا المنتج الجانبي. لتجفيف المذيبات ، تباع المناخل الجزيئية من النوع 4 Å معبأة مسبقا في أكياس تفلون متوافقة مع معظم المذيبات العضوية تحت أسماء تجارية مختلفة من قبل معظم شركات كاشف توليف أوليغونوكليوتيدات. الاحتياطات الإضافية ، مثل إجراء الفسفرة الثلاثية في صندوق قفازات تحت جو لا مائي ، ليست ضرورية بشكل عام.
يشكل تفاعل أوليغونوكليوتيد 5′-فوسفيتيل مع TBAP وسيطا دوريا 5′-trimetaphosphite ، والذي يتأكسد بعد ذلك إلى 5′-trimetametaphosphate الدوري باستخدام محلول مؤكسد توليف oligonucleotide (اليود في الماء / البيريدين / THF). تجدر الإشارة إلى أن محاليل المؤكسدات التجارية تستخدم كميات متفاوتة من اليود ، ومن الضروري استخدام تركيز اليود العالي 0.1 M لضمان الأكسدة الكاملة لثلاثي الفوسفات. يتم تحلل المنتج الدوري إلى الخيط الخطي النهائي 5′-triphosphate في نفس المحلول37 ، ويجب استخدام محاليل المؤكسدة اللامائية البديلة إذا كان الخطية مع النيوكليوفيلات بخلاف الماء مطلوبة (انظر أدناه للتطبيقات)33. ومع ذلك ، فإن أي ثلاثي ميتافوسفات دوري متبق ، سيتم خطيه أثناء إزالة الحماية القلوية اللاحقة من oligonucleotide. التحلل المائي للثلاثي فوسفات الدوري 5′-trimetasphate لا ينتج عنه سوى ثلاثي الفوسفات الخطي بدلا من ثلاثي الفوسفات المتفرع 37,46.
لا تحتاج إزالة الحماية من أوليغونوكليوتيد عادة إلى تعديل لاستيعاب 5 ′-triphosphorylation ، ولكن يجب اتخاذ بعض الاحتياطات. الثلاثي الفوسفات مستقر نسبيا للتعرض لفترة وجيزة للظروف القلوية ، ولكن يجب توخي الحذر لعدم تعريض ثلاثي الفوسفات ل AMA لفترة أطول من اللازم. يجب تجنب حماية المجموعات التي تتطلب علاجا مطولا في الأمونيا أو AMA لأكثر من 10 دقائق عند 65 درجة مئوية. العلاجات الأكثر لطفا ، مثل 2 ساعة في الأمونيا في درجة حرارة الغرفة مقبولة عندما تكون متوافقة مع مجموعات حماية الفوسفوراميديت الأخرى. تستخدم طريقة شائعة وسريعة لإزالة الحماية من الحمض النووي الريبي الاصطناعي oligonucleotides المحمية من السيليل ثلاثي إيثيلامين ثلاثي هيدروفلوريد ودرجة حرارة عالية47 ؛ ومع ذلك ، ينبغي تجنب ذلك عند تحضير الحمض النووي الريبي 5 ′ ثلاثي الفوسفات حيث تم العثور على الظروف الحمضية المطولة لتسريع التحلل المائي ثلاثي الفوسفات31,32.
وقد أثبتت الصفحة التحضيرية أنها الطريقة الأبسط والأكثر موثوقية لتنقية أوليغونوكليوتيدات 5 ثلاثي الفوسفوريلات بعد الحماية (الشكل 3 والشكل 4). ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام HPLC في المرحلة العكسية التحضيرية لتنقية المنتجات ثلاثية الفوسفوريلات. ويلاحظ وجود 5′-ثنائي الفوسفات، وبدرجة أقل، منتجات 5′-monophosphate بشكل روتيني عند التحقق من الفسفرة الثلاثية عن طريق قياس الطيف الكتلي. لقد لاحظنا تفتيت 5 ′ ثلاثي الفوسفات أثناء قياس الطيف الكتلي من مواد عالية النقاء يتم إعدادها عن طريق التوليف الكيميائي أو النسخ ، خاصة إذا لم يتم تحسين الأداة لتحليل oligonucleotides. ومع ذلك ، غالبا ما يظهر تحليل RP-LC أن 10٪ -20٪ من المنتج الجانبي 5 ′ ثنائي الفوسفات موجود في أوليغونوكليوتيدات أطول 5 ′ ثلاثي الفوسفور (الشكل 4). يمكن أن تكون المستحضرات التجارية لبيروفوسفات تريبوتيلامونيوم ملوثة بما يصل إلى 20٪ أحادي الفوسفات ، مما سيؤدي إلى 5 ′-diphosphate كمنتج جانبي أثناء الفسفرة الثلاثية30,31. يمكن أن يؤدي الإعداد الدقيق لهذا الكاشف في المنزل إلى إنتاج مخزون TBAP أكثر نقاء31. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن oligonucleotides triphosphorylated باستخدام مصادر تجارية من TBAP لا تزال تظهر تفاعلا مماثلا أو أكبر عند استخدامها كركائز في التفاعلات الأنزيمية (الشكل 5B) ، مقارنة بالمواد التي يتم إعدادها بواسطة النسخ في المختبر.
أحد الاستخدامات الأخرى البارزة لفسفرة أوليغونوكليوتيد ثلاثية الفسفرة مع كاشف لودفيغ-إيكشتاين يستفيد من ثلاثي الميتافوسفيت الدوري الوسيط33. إذا تم إجراء خطوة الأكسدة اللاحقة باستخدام بيروكسيد 1 M t-butyl في الهكسانات ، والذي يستخدم غالبا لأكسدة oligonucleotide في ظل الظروف اللامائية ، تحدث أكسدة الفوسفيت دون التحلل المائي لفتح الحلقة ، مما يؤدي إلى ثلاثي ميتافوسفات دوري. يمكن بعد ذلك تفاعل هذا الوسيط مع الأمين الأولي أو نيوكليوفيلات الكحول لإنتاج 5 ′ ثلاثي الفوسفات مع تعديلات في γ الفوسفات. وتشمل هذه التعديلات إضافة علامة محبة للدهون مرتبطة برابطة فوسفوراميدات ، مما يسهل التنقية السريعة الخاصة بثلاثي الفوسفات بواسطة RP-LC ، تليها التحلل المائي الحمضي للعلامة من ثلاثي الفوسفات33. يمكن أيضا إدخال تعديلات الفلورسنت في موقع γ الفوسفات لاستخدامها كمراسلين فلورسنت في الوقت الفعلي لتفاعلات الربط المحفزة بالريبوزيم15,33.

شكل 5′-triphosphorylated من الحمض النووي الريبي هو في كل مكان في علم الأحياء كما يتم إنشاؤه عن طريق نسخ الحمض النووي الريبي في جميع مجالات الحياة وعن طريق تكرار الحمض النووي الريبي خلال دورة حياة العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي. هذه التريفوسفات بمثابة الركيزة لتشكيل mRNA 7-methylguanylate المغطاة في حقيقيات النوى ، وبالتالي ، تلعب دورا أساسيا في التعبير عن البروتين1. في المقابل ، يتم الاحتفاظ بالفوسفات الثلاثي في البكتيريا والفيروسات. وبالتالي ، يتم التعرف على الحمض النووي الريبي 5 ′ ثلاثي الفوسفات من قبل منظمي الاستجابة للمناعة الفطرية في حقيقيات النوى2،3،4،5،6،7. خارج علم الأحياء ، تم تطوير مجموعة من ريبوزيمات الحمض النووي الريبي ليغاز لاستخدام 5 ′ ثلاثي الفوسفات في المختبر8 وتعديلها للاستخدام في الفحوصات التشخيصية9،10،11،12،13،14،15. يمكن استخدام أحد هذه الإنزيمات الريبوزية للتخليق المعتمد على القالب ل L-RNA ، وهو enantiomer "صورة مرآة" غير بيولوجي ل D-RNA الطبيعي ، من قليل النوكليوتيد L-RNA 5 ′ - ثلاثي الفوسفات16،17،18. يعد التحضير الروتيني لأوليغونوكليوتيدات ثلاثي الفوسفوريلات ذات التسلسل المختلف وتكوين العمود الفقري أمرا ضروريا للتحقيق في هذه الأنظمة.
الطريقة الأكثر شيوعا والتي يمكن الوصول إليها لإعداد الحمض النووي الريبي 5′-ثلاثي الفوسفات في المختبر هي عن طريق النسخ في المختبر. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الريبي الذي تنتجه هذه الطريقة مقيد في التسلسل والحجم حسب متطلبات المروج والركيزة لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي. بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ومشتقاته المتخصصة هي البوليميراز الأكثر شيوعا المستخدمة لهذا الغرض19،20،21،22. يجب أن يبدأ الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر المحضر بهذه الإنزيمات باستخدام البيورين المكون من 5 أطراف وهو منحاز بشدة نحو البيورينات في أول 10 نيوكليوتيدات23,24. علاوة على ذلك ، فإن الدمج الأنزيمي للنيوكليوتيدات المعدلة بالقاعدة أو العمود الفقري غير فعال في أحسن الأحوال وغالبا ما يكون مستحيلا مع البوليميراز الطبيعي ، مما يحد من فرصة إنتاج أوليغونوكليوتيد 5 ′ ثلاثي الفوسفات يتكون من أي شيء باستثناء الحمض النووي الريبي D-RNA الطبيعي. عامل آخر مقيد هو أن الحمض النووي الريبي الناتج عن النسخ في المختبر يمكن أن يحتوي على عدم تجانس كبير 5 و 3 ويتم إنتاجه كمنتجات غير متجانسة للغاية عندما يكون أقصر من 20 nt 23,24,25,26,27.
في المقابل، يمكن استخدام الفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات المحضرة بواسطة تخليق الفوسفوراميديت ذي الطور الصلب28،29،30،31،32،33،34،35 لإعداد أوليغونوكليوتيد 5 ′-ثلاثي الفوسفات 3-50 نانوت طويلة، من أي تسلسل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إضافة مجموعة واسعة من تعديلات الحمض النووي التي يمكن الوصول إليها لتخليق الفوسفوراميديت إلى oligonucleotides قبل 5′-triphosphorylation 14,15,16,17,18,29,36. تستخدم العديد من هذه الطرق كاشف الفوسفيتيل ساليسيل فوسفوروكلوريديت ، الذي طوره لودفيغ وإيكشتاين لمرحلة الحل ثلاثية الفسفرة من أحادي النوكليوسيدات37. يتم تحقيق الفسفرة الثلاثية للأوليغونوكليوتيدات مع هذا الكاشف في المرحلة الصلبة عن طريق فوسفيتيل أوليغونوكليوتيد 5′-هيدروكسيل ، وتحويله إلى ثلاثي الفوسفات عن طريق التفاعل مع بيروفوسفات والأكسدة ، تليها الإجراءات القياسية لانقسام أوليغونوكليوتيد من الدعم الصلب ، وإزالة الحماية ، والتنقية (الشكل 1) 28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> الشكل 1: مخطط للفسفرة الثلاثية للأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية. في الخطوة الأولى ، يتم فوسفيتيل oligonucleotide 5ʹ-hydroxyl مع SalPCl. في الخطوة التالية ، يتم تفاعل فوسفيت 5ʹ-salicyl مع TBAP لتشكيل metaphosphite الدوري ، ثم في الخطوة الثالثة يتأكسد لتوليد الفوسفات الدوري 5ʹ-trimetametasphate في محلول أكسدة مركب الحمض النووي / الحمض النووي الريبي (0.1 M Iodine / pyridine / H2O / THF) ، والذي يتم تحلله بسرعة لإنتاج الخطي 5ʹ-triphosphate في نفس المحلول28,33 ، 37. سيؤدي الانقسام القلوي اللاحق من دعم CPG الصلب وإزالة الحماية من oligonucleotide في MeNH2 / الأمونيا المائية إلى تحلل أي ثلاثي ميتافوسفات دوري متبقي إلى الشكل الخطي. الاختصارات: SalPCl = ساليسيل فوسفوروكلوريديت; TBAP = ثلاثي التيلامونيوم بيروفوسفات; THF = رباعي هيدروفوران. CPG = زجاج المسام الذي يتم التحكم فيه ؛ MeNH2 = ميثيل أمين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
على الرغم من أن التقارير المنشورة في وقت مبكر باستخدام هذه الطريقة غالبا ما عانت من ضعف الغلة والمنتجات الجانبية غير المرغوب فيها28،37،38 ، إلا أن الصيانة الدقيقة للظروف اللامائية هي كل ما هو ضروري للحصول على غلات عالية بشكل روتيني. يمكن تحقيق ذلك عن طريق التحضير الدقيق للكواشف واستخدام جهاز تفاعل بسيط يتم تجميعه من مكونات بلاستيكية قياسية. هنا ، نوضح الخطوات المناسبة للفسفرة الثلاثية الكيميائية للأوليغونوكليوتيدات ، بما في ذلك تحضير الكواشف ، وتجميع غرفة التفاعل ، وتفاعل الفسفرة الثلاثية ، وإزالة الحماية والتنقية اللاحقة من أوليغونوكليوتيدات ثلاثي الفوسفوريلات. ويشمل أيضا الاستخدام التمثيلي ل 5′-triphosphorylated oligonucleotides كركائز لريبوزيمات الليغاز لتخليق منتجات الأحماض النووية الأكبر مع الحمض النووي الريبي D-RNA الطبيعي والعمود الفقري L-RNA اللاأحيائي.

<table><tbody><tr><td>0.22 وميكرو ؛ م مرشح حقنة بولي إيثر سلفون</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>مرشح حقنة لإزالة جزيئات هلام بولي أكريلاميد المكسرة (القسم 5)</td></tr> <tr><td>0.22 & م PTFE حقنة فلتر</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>مرشح حقنة لإزالة راتنج CPG (القسم 5)</td></tr> <tr><td>1 مل محاقن بلاستيكية</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659) مكونات</td> <td>جهاز الفسفرة الثلاثية (الأقسام 2 & ndash ؛ 4)</td></tr> <tr><td>1،4-ديوكسان ، مذيب</td><td>MilliporeSigma</td><td>اللامائي 296309</td><td>ثلاثي الفسفرة (الأقسام 2 & ndash ؛ 4)</td></tr> <tr><td>2-Chloro-4H-1،3،2-benzodioxaphosphorin-4-one ، Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>كاشف ثلاثي الفسفرة (الأقسام 2 & ndash ؛ 4)</td></tr> <tr><td>زجاجات زجاجية سعة 30 مل زجاجات</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>لتحضير مذيبات الفسفرة ثلاثية الفسفرة ومحلول TBAP (القسم 2)</td></tr> <tr><td>3 اتجاهات Stopcock ، مختبرات البولي كربونات / البولي بروبيلين</td><td>Bio-Rad</td><td>7328103</td><td>مكون من جهاز الفسفرة الثلاثية (الأقسام 2 & ndash ؛ 4)</td></tr> <tr><td>40٪ محلول أكريلاميد / ثنائي أكريلاميد ، 19: 1</td><td>مختبرات Bio-Rad</td><td>1610144</td><td>للصفحة (الأقسام 5 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>الأسيتونيتريل ، اللامائي ، 100 مل</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>مذيب ثلاثي الفسفرة (الأقسام 2 & ndash ؛ 4)</td></tr> <tr><td>مصيدة تحييد الأمونيا</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 و ANS121</td><td>للاستخدام مع Speedvac DNA130 (القسم 5)</td></tr> <tr><td>بيرسلفات الأمونيوم (APS)</td> <td>مختبرات Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>ل PAGE ، محفز لبلمرة الأكريلاميد (الأقسام 5 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>الأمونيا المائية ، 28٪</td> <td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>لتحضير كاشف إزالة الحماية AMA (القسم 5)</td></tr> <tr><td>الميثيل أمين المائي ، 40٪</td> <td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>لتحضير كاشف إزالة الحماية AMA (القسم 5)</td></tr> <tr><td>مركب قليل النوكليوتيدات الآلي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>تسريع 8909 مركب DNA / RNA</td><td>أي مركب قائم على العمود مقبول (القسم 1)</td></tr><tr><td>مغناطيس التقاط الخرزة</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>لالتقاط حبة الستربتافيدين (القسم 7)</td></tr> <tr>مختبرات <td>بروموفينول الأزرق</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>لعازلة تحميل اليوريا PAGE (القسم 5)</td></tr> <tr><td>مضخة زيت الفراغ العميق</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>للاستخدام مع المجفف بالتجميد (القسم 5)</td></tr> <tr><td>مجفف Drierite ، 10-20 شبكة</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>مجفف لتخزين المواد الكيميائية والمعدات ثلاثية الفسفرة (الأقسام 1 & ndash ؛ 2)</td></tr> <tr><td>D-RNA 27.3t بوليميراز متقاطع لولبي</td><td>محضر في المنزل 18 </td><td>5 &PRIME ؛ -GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3 &PRIME ؛</td><td>لتفاعلات الريبوزيم عبر اللولبية (القسم 7)</td></tr>يدعم <tr><td>D-RNA CPG الصلبة ، 1,000 & Aring ؛ معبأة مسبقا 1 & micro ؛ أعمدة تخليق الخلد Glen</td><td>Research</td><td>20-3404-41E ، 20-3415-41E ، 20-3424-41E ، 20-3430-41E</td><td>ممثل ، لتخليق قليل النوكليوتيدات D-RNA (القسم 1)</td></tr> <tr><td>D-RNA TOM-المحمية بالفسفراميديت</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201 ، 3202 ، 3203 ، 3205</td><td>ممثل ، لتخليق قليل النوكليوتيدات D-RNA (القسم 1)</td></tr> <tr><td>أعمدة التوليف المعجل الفارغة ، 1 & micro ؛ m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>أعمدة التوليف للاستخدام مع مركب الحمض النووي المسرع / الحمض النووي الريبي (القسم 1)</td></tr> <tr><td>EPPS ، N- (2-Hydroxyethyl) piperazine-N & Prime ؛ - (3-حمض البروبانسلفونيك) ،</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>مكون عازلة لتفاعل Ribozyme (القسم 6) حمض</td></tr> <tr><td>الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، مخلب أيون</td> معدني متكافئ صلب <td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>للاستخدام في المخازن المؤقتة المختلفة ( الأقسام 5 &ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>مرشحات لأعمدة التوليف السريع Glen</td><td>Research</td><td>20-0021-0F</td><td>مرشحات عمود التوليف على غرار Expedite ، للاستخدام مع أعمدة التوليف الفارغة (القسم 1)</td></tr> <tr><td>الماسح الضوئي للجل الفلوري / الفسفور</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB ، 29187193</td><td>لتصور PAGE التحليلي (الأقسام 6 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>الفورماميد ، منزوع الأيونات</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>لعازلة تحميل هلام فورماميد PAGE (الأقسام 6 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>برنامج تحديد كمية الصور</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>لقياس صور الهلام الممسوحة ضوئيا (القسم 6)</td></tr> <tr><td>مجفف الزجاج</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>تخزين مذيبات ثلاثي الفسفرة (القسم 2) يدعم</td></tr> <tr><td>L-RNA CPG الصلبة ، 1،000 & ، ChemGenes السائبة</td><td></td><td>N-4691-10 ، N-4692-10 ، N-4693-10 ، N-4694-10</td><td>L-RNA قليل النوكليوتيدات (القسم 1)</td></tr><tr><td>قالب المطرقة L-RNA</td><td>أعدت في المنزل 18 </td><td>5 & prime ؛ -GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3 & prime ؛</td><td>لتفاعلات الريبوزيم عبر اللولبية (القسم 7)</td></tr><tr><td>L-RNA التمهيدي</td><td>المحضر في المنزل 18</td><td>5 & prime ؛ -fluorescein-GGCUCGA-3 & prime;</td><td>لتفاعلات الريبوزيم عبر اللولبية (القسم 7)</td></tr><tr><td>L-RNA TOM المحمية من الفوسفوراميديت</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201 ، 5202 ، 5203 ، 5205</td><td>تخليق قليل النوكليوتيدات L-RNA (القسم 1)</td></tr> <tr><td>مجفف Lyophilizer / Freeze</td><td>Dryer VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>لتركيز قليل النوكليوتيدات (القسم 5)</td></tr> <tr><td>سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم ، صلب</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>لتفاعلات الريبوزيم (الأقسام 6 &ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>N ، N-Dimethylformamide ،</td> مذيب <td>MilliporeSigma</td><td>227056</td> اللامائي <td>(القسم 2)</td></tr> <tr><td>عمود تحلية المياه NAP-25 (راتنج Sephadex G-25) ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>45000150</td><td>أعمدة كروماتوغرافيا استبعاد حجم تدفق الجاذبية القابل للتصرف تحتوي على راتنج Sephadex G-25 (القسم 5)</td></tr> <tr><td>إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ غير محفورة ، 20 جم</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>إبر لثقب الحاجز المطاطي (الأقسام 2 &ndash; 4)</td></tr> <tr><td>حاسبة معامل انقراض قليل النوكليوتيدات</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة</td><td>أداة OligoAnalyzer</td><td>نموذج أقرب جار قصير قليل النوكليوتيد 260 نانومتر حاسبة معامل الانقراض (القسم 5)</td></tr> <tr><td>محلول مؤكسد ، 0.1 متر يود في THF / البيريدين / الماء</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>كاشف ثلاثي الفسفرة (القسم 4)</td></tr> <tr><td>لوحات الصفحة</td><td>Timberrock / CBS</td><td>NGP-250-BO و NO</td><td>بالنسبة إلى PAGE (الأقسام 5 &ndash; 7)</td></tr> <tr><td>PAGE مزود الطاقة</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>ل PAGE (الأقسام 5 &ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>فواصل الصفحة والأمشاط (التحليلية)</td> <td>Timberrock / CBS</td><td>VGS-0725 و VGC-0714</td><td>للصفحة (الأقسام 6 &ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>فواصل الصفحة والأمشاط (التحضيرية)</td> <td>Timberrock / CBS</td><td>VGS-3025R و VGC-3001</td><td>للصفحة (القسم 5)</td></tr> <tr><td>حامل الصفحة</td><td>Timberrock / CBS</td><td>ASG-250</td><td>للصفحة (الأقسام 5 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td> <td>فيلم ختم الشمع لجهاز الفسفرة (الأقسام 2 & ndash ؛ 4)</td></tr> <tr><td>PCR thermocycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Thermalcycler</td><td>لتفاعلات الريبوزيم اللولبية المتقاطعة (القسم 7)</td></tr> <tr><td>PD 10 عمود تحلية المياه (راتنج Sephadex G-10)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>أعمدة كروماتوغرافيا استبعاد حجم تدفق الجاذبية القابل للتصرف تحتوي على راتنج Sephadex G-10 ، لقليل النوكليوتيدات < lt 15 nt (القسم 5)</td></tr> <tr><td>شاشات الفوسفور</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>لتصور 32 RNA المسمى P (القسم 6)</td></tr> <tr><td>كواشف تخليق الفوسفوراميديت</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52 ، 40-4050-53 ، 40-4012-52 ، 40-4122-52 ، 40-4132-52 ، 40-4060-62</td><td>، لتخليق الحمض النووي الريبي / الحمض النووي القياسي (القسم 1)</td></tr> <tr><td>أنبوب بولي بروبيلين لولبي قابل للغلق</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>أنابيب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مع غطاء لولبي وحلقة سيليكون O ، لإزالة الحماية الآمنة من AMA ( القسم 5)</td></tr> <tr><td>بيريدين ، اللامائي</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>مذيب ثلاثي الفسفرة (القسم 2)</td></tr> <tr><td>الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور العكسي / قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي (RP-LC / ESI-MS)</td> <td>Novatia</td><td>n / a</td><td>خدمة تجارية ل LC / MS المتخصصة في قليل النوكليوتيدات (القسم 5) الحاجز</td></tr> <tr><td>المطاطي (المعرف × OD 7.9 مم × 14 مم) ، أبيض</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>الحاجز لتحضير مذيبات ثلاثي الفسفرة و TBAP (القسم 2)</td></tr> <tr><td>الريبوزيم ذاتي النسخ المكرر E</td><td>المحضرة في المنزل 14 </td> <td>5 &PRIME ؛ -GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3 &PRIME ؛</td><td>لتفاعلات الريبوزيم ذاتية النسخ المتماثل (القسم 6)</td></tr><tr><td>الركيزة ذاتية النسخ A</td><td>المحضرة في المنزل 14</td><td>5 & prime ؛ -32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAGUA U-3 &PRIME ؛ -OH</td><td>لتفاعلات الريبوزيم ذاتية النسخ المتماثل (القسم 6)</td></tr> <tr><td>الركيزة ذاتية النسخ B ، المنسوخة</td><td>المعدة في المنزل 14</td><td>5 & prime ؛ -pppGAGACCGCAA CUUA-3 & prime ؛</td><td>لتفاعلات الريبوزيم ذاتية النسخ المتماثل (القسم 6)</td></tr><tr><td>مصائد التجفيف الصغيرة ، 4 & Aring ؛ المناخل الجزيئية</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>مصائد التجفيف لمركب الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الفوسفوراميديت والكواشف ثلاثية الفسفرة (الأقسام 1 & ndash ؛ 2)</td></tr> <tr><td>كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، ملح</td><td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td> الصلب <td>للاستخدام في المخازن المؤقتة المختلفة (الأقسام 5 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، ملح</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>الصلب للاستخدام في المخازن المؤقتة المختلفة (الأقسام 5 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>برنامج تركيب البيانات الإحصائية</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>لتركيب البيانات من PAGE التحليلي إلى النماذج الحركية (القسم 6)</td></tr> <tr><td>الخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>لالتقاط الحمض النووي الريبي المسمى بالبيوتين في تفاعلات الريبوزيم عبر اللولبية (القسم 7)</td></tr> <tr><td>السكروز</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>للمخزن المؤقت لتحميل اليوريا PAGE (القسم 5)</td></tr> <tr><td>TBE تشغيل المخزن المؤقت ، 10x</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific AAJ62788K3</td><td>ل PAGE (الأقسام 5 &ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>فلوريد رباعي بوتيل لامونيوم ، محلول 1.0 متر في 216143 Tetrahydrofuran</td><td>Aldrich</td><td></td><td>لإزالة مجموعات حماية 2 & prime ؛ -silyl (القسم 5) Tetramethylethylenediamine</td></tr> <tr><td>(TEMED)</td> <td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610801</td><td>لبلمرة مادة الأكريلاميد ل PAGE (الأقسام 5 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>Tributylamine</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>كاشف ثلاثي الفسفرة (القسم 2)</td></tr> <tr><td>Tributylammonium pyrophosphate (TBAP)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>كاشف ثلاثي الفسفرة (القسم 2)</td></tr> <tr><td>Tris base</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>عامل التخزين المؤقت للاستخدام في المخازن المؤقتة المختلفة (الأقسام 5 &ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>TWEEN20 منظف بولي سوربات</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>منظف محايد للاستخدام مع الخرز المغناطيسي (القسم 7)</td></tr> <tr><td>اليوريا</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>للصفحة والهلام تحميل المخزن المؤقت (الأقسام 5 & ndash ؛ 7)</td></tr> <tr><td>مقياس الطيف الضوئي UV-Vis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000 ، ND2000</td><td>لقياس تركيزات قليل النوكليوتيدات (القسم 5)</td></tr> <tr><td>جهاز الطرد المركزي الفراغي</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 مكثف الفراغ</td><td>لإزالة AMA و THF (القسم 5)</td></tr> <tr>مختبرات <td>الزيلين السيانول</td><td>Bio-Rad</td><td>1610423</td><td>لمخزن تحميل اليوريا PAGE (القسم 5)</td></tr></tbody></table>

الفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

ال 5′-triphosphate هو تعديل أساسي للحمض النووي موجود طوال الحياة ويستخدم بشكل متزايد كتعديل وظيفي للأوليغونوكليوتيدات في التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية. تم تحضير Oligonucleotide 5′-triphosphates تاريخيا في المختبر بطرق إنزيمية. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرق على أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي الطبيعية ، ولها تفضيلات تسلسل قوية ، وتميل إلى إنتاج منتجات غير متجانسة. تكمل الطرق الجديدة للفسفرة الثلاثية الكيميائية كلا من التكلفة المخفضة لتخليق أوليغونوكليوتيد الآلي بواسطة كيمياء الفوسفوراميديت ومجموعة متنوعة من تعديلات النيوكليوتيدات المتاحة الآن. وبالتالي ، فإن تخليق ثلاثي فوسفات oligonucleotide من التسلسل والطول التعسفيين ، والذي يحتوي اختياريا على تعديلات غير طبيعية مختلفة ، أصبح الآن متاحا الآن.
تعرض هذه الورقة الطرق والتقنيات المناسبة للفسفرة الثلاثية الكيميائية للأوليغونوكليوتيدات باستخدام فوسفوروكلوريد الساليسيل والبيروفوسفات. تستخدم هذه الطريقة الكواشف المتاحة تجاريا ، وهي متوافقة مع معظم النوكليوتيدات القليلة التي يتم إعدادها بواسطة طرق توليف الطور الصلب القياسية ، ويمكن إكمالها في 2 ساعة بعد تخليق oligonucleotide ، قبل إزالة الحماية والتنقية. تم توضيح استخدامين لأوليغونوكليوتيدات ثلاثي الفوسفوريلات كيميائيا كركائز لإنزيمات الحمض النووي الريبي الحفازة ، بما في ذلك تخليق نسخة صورة طبق الأصل من ريبوزيم رأس المطرقة من ثلاثي الفوسفات L-RNA غير البيولوجي.

يجب تصنيع أوليغونوكليوتيدات باستخدام بروتوكولات قياسية مناسبة للفوسفوراميديت ومركب الحمض النووي الآلي / الحمض النووي الريبي ، تاركة المنتج أوليغونوكليوتيد غير منكعب من الدعم الصلب في عمود التوليف البلاستيكي الأصلي ، مع إزالة مجموعة ثنائي إيميثوكسيتيل 5'-terminal لإنتاج 5ʹ-hydroxyl الحر (القسم 1). تم تحضير جميع النوكليوتيدات قليلة النوكليوتيدات المستخدمة في هذا العرض باستخدام راتنج زجاج المسام المتحكم فيه (CPG) 1000 Å كدعم صلب وتم إجراؤه على مقياس 0.2 أو 1 ميكرومول. يتم توفير أمثلة تمثيلية لأعمدة التوليف والراتنجات والكواشف والفوسفوراميدات في جدول المواد. بالنسبة للتفاعلات واسعة النطاق ، قد تحتاج إلى تعديل الأحجام والأوقات المستخدمة في الخطوات اللاحقة.
يتم إجراء تفاعل الفسفرة الثلاثية على عمود في غرفة تفاعل مصممة خصيصا (الشكل 2 ، القسم 3) باستخدام المكونات القياسية المتاحة تجاريا المدرجة في جدول المواد ويتبع المخطط الموضح في الشكل 1 (القسم 4) 28. من الضروري أن تبقى الظروف لامائية بشكل صارم أثناء الفسفرة الثلاثية ، وأن يتم تحضير جميع المذيبات والكواشف على المناخل الجزيئية مقدما والسماح لها بالجفاف الكامل قبل الاستخدام (القسم 2). عادة ما يستغرق الفسفرة الثلاثية 2 ساعة ليحدث ، وبعد ذلك ، يمكن معالجة العمود المغسول والمجفف وفقا لإجراءات إزالة وتنقية oligonucleotide القياسية (القسم 5).
بعد إزالة الحماية ، يتم تنقية ثلاثي فوسفات oligonucleotide عن طريق تمسخ الرحلان الكهربائي لهلام polyacrylamide (PAGE) ، مما يدل على نطاق منتج رئيسي واحد بواسطة التظليل الخلفي للأشعة فوق البنفسجية التي يمكن استئصالها وإزالتها من الجل. يتم فصل منتج 5′-triphosphate بسهولة عن المنتجات الجانبية للتفاعل ل oligonucleotides القصيرة ، كما هو موضح ل DNA trinucleotide 5ʹ-triphosphates و pppAAA و pppCCC ، و L-RNA trinucleotide 5ʹ-triphosphate pppGAA في الشكل 3A ، B. تم استئصال كل من منتجات 5′-hydroxyl و 5′-triphosphate لآلات تشذيب الحمض النووي AAA و CCC وتحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي وتم تصنيفها بالمقابل في الشكل 3A. النطاقات الإضافية ، كما هو مرئي لأداة تشذيب الحمض النووي AAA ، لا تحتوي عموما على مواد كافية لاستعادتها وتحديدها. ومع ذلك، يرتبط وجود هذه النطاقات بكتل منتجات إضافية في منتجات التفاعل غير النقية (الشكل 3C)، والتي تمثل عادة منتجات جانبية 5′-diphosphate، وmonophosphate، وH-phosphonate، كما هو موضح أدناه.
بعد تنقية PAGE ، يمكن التخلص من أوليغونوكليوتيدات أكبر باستخدام طريقة السحق والنقع42 وهطول الأمطار اللاحق للإيثانول. ومع ذلك ، لا يمكن ترسيب الأوليغنوكليوتيدات التي تقل عن 15 نانول بكفاءة ، وبالتالي ، تتطلب إجراء معدلا لإزالة الجل (الخطوة 5.11.3). يتم تصنيف عمود استبعاد الحجم القابل للتصرف المدرج في جدول المواد فقط للاستخدام مع oligonucleotides أطول من 10 nt. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن oligonucleotides قصيرة مثل التريبر يمكن تحميصها بشكل فعال باستخدام البروتوكول الموصى به من قبل الشركة المصنعة. ومع ذلك ، يوصى عند تحلية أوليغونوكليوتيدات قصيرة (كما هو الحال في الخطوتين 5.6 و 5.11.3) بجمع عمود اللوح في كسور ، وتحديد كسور المنتج عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV-Vis. يتم توفير عمود استبعاد الحجم الأمثل لأوليغونوكليوتيدات أقصر في جدول المواد كخيار بديل. العائد النهائي من تخليق أوليغونوكليوتيد مقياس 1 ميكرومول بعد التنقية هو 50-300 نانومول.
يمكن تأكيد الفسفرة الثلاثية عن طريق قياس الطيف الكتلي ، حيث يكون للمنتج ثلاثي الفسفرة كتلة +239.94 Da أكبر من أوليغونوكليوتيد 5′-hydroxyl ، على الرغم من أن وجود المواد المقابلة ل 5′-di- و monophosphate (+159.96 و +79.98 Da ، على التوالي) غالبا ما يتم ملاحظته. يمكن أيضا ملاحظة منتج جانبي 5′-H-phosphonate بكتلة +63.98 Da من كتلة 5′-OH ، وتشير المستويات العالية من هذا المنتج إلى أن الظروف أثناء الفسفرة الثلاثية لم تكن لامائية بما فيه الكفاية. قبل التنقية ، ستعرض أوليغونوكليوتيدات غير المحمية عادة جميع هذه المنتجات (الشكل 3C) ، في حين أن المواد النقية ستظهر ذروة تتوافق مع منتج 5 ′ ثلاثي الفوسفات جنبا إلى جنب مع 5 ′ di- و monophosphates (الشكل 3D ، E).
عادة ما لا يعطي قياس الطيف الكتلي وحده مقياسا صارما لنقاء 5 ′ ثلاثي الفوسفات بسبب المعدلات التفاضلية للتأين وتفتيت ثلاثي الفوسفات أثناء التأين. لقياس نقاء المنتج النهائي، يوصى باستخدام كروماتوغرافيا سائلة ذات طور عكسي وترادف ESI-MS (RP-LC/ESI-MS)، خاصة بالنسبة للأوليغونوكليوتيدات الأطول. يظهر تحليل D-RNA 5ʹ-triphosphates pppACGAGG و pppGAGACCGCAACUUA بواسطة RP-LC / ESI-MS (الشكل 4A ، B ، على التوالي) نقاء المنتج النهائي النموذجي ، الذي يحتوي على 20٪ 5'-diphosphate حيث يصعب فصل هذين النوعين عند وجودهما على أوليغونوكليوتيدات أطول.
عادة ما تعمل أوليغونوكليوتيدات قليلة الفوسفات الاصطناعية 5 ′ ثلاثي الفوسفات بشكل جيد أو أفضل من المواد المحضرة إنزيميا في الدراسات الكيميائية الحيوية. في القسم 6 ، على سبيل المثال ، تمت مقارنة ركائز الحمض النووي الريبي 5′-triphosphate 14 nt المحضرة إما صناعيا أو عن طريق النسخ في المختبر في تفاعل التكرار الذاتي المحفز للحمض النووي الريبي 14,15,43,44,45. يحفز الريبوزيم E انضمام الركيزتين A و B لإنتاج نسخة جديدة من E في تفاعل محفز ذاتي قادر على النمو الأسي (الشكل 5A). تم إعداد المكونات E و 32P الموسومة A عن طريق النسخ في المختبر ، وتم تحضير الركيزة الثلاثية الفوسفوريلات B إما صناعيا ، كما هو موضح أعلاه ، أو عن طريق النسخ المختبري 14. تم رصد تقدم تفاعل التكرار الذاتي عن طريق أخذ عينات دورية تم تحليلها عن طريق تمسخ PAGE وتحديدها كميا عبر ماسح هلام الفلورسنت / الفوسفورسنت. وكشفت البيانات الناتجة، التي تتناسب مع دالة النمو اللوجستي، أن الركيزة B المنسوخة أو الاصطناعية تدعم النمو الأسي، ولكن B الاصطناعية تعطي كمية أكبر قليلا من المنتج (الشكل 5B). قد تعكس هذه النتيجة عدم التجانس التركيبي في نهاية 5 ′ من الحمض النووي الريبي الذي تم إعداده بواسطة النسخ المختبري 23,24.
كما تمكن الفسفرة الثلاثية الكيميائية من تخليق ثلاثي فوسفات أوليغونوكليوتيد الذي لا يمكن تحضيره بيولوجيا ، سواء في المختبر أو في الخلايا. في القسم 7 ، تم استخدام ثلاثي فوسفات أوليغونوكليوتيد غير بيولوجي يتكون من L-RNA ، وهو enantiomer من D-RNA الطبيعي ، المحضر كما هو الحال في الأقسام 1-5 ، كركائز لريبوزيم البوليميراز D-RNA "عبر chiral" 27.3t (الشكل 6A) ، الذي يحفز البلمرة الموجهة بالقالب لمنتج L-RNA أطول من أوليغونوكليوتيد L-RNA القصير 5 ′ ثلاثي الفوسفات بطريقة عامة تسلسلية. على سبيل المثال ، يمكن للريبوزيم توليف نسخة L-RNA من زخارف الانقسام الذاتي لرأس المطرقة (الشكل 6B)18. تم الجمع بين ثلاثي فوسفات ثلاثي النوكليوتيد L-RNA المنقى مع التمهيدي L-RNA المسمى بالفلوريسين وقالب L-RNA (الشكل 6C) وتفاعلت مع الليغاز عبر chiral. تم تحليل العينات على مدار التفاعل بواسطة PAGE وتصويرها باستخدام ماسح ضوئي هلام فلوري / فوسفوري لإثبات تخليق نسخة L-RNA من ريبوزيم رأس المطرقة المشفر بواسطة القالب (الشكل 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> الشكل 3: تنقية ثلاثي النوكليوتيد 5'-ثلاثي الفوسفات. (أ) تحليل الصفحة (المتصور بواسطة التظليل الخلفي للأشعة فوق البنفسجية) للفسفرة الثلاثية لثلاثي النوكليوتيدات الحمض النووي ثلاثي ديوكسي أدينوسين (AAA ، أزرق) وثلاثي ديوكسي سيتيدين (CCC ، أحمر) ، مثقل عمدا لتصور المنتجات الجانبية الثانوية. تم استئصال كل من منتج 5'-triphosphate (ppp) والمواد الأولية 5ʹ-hydroxyl (OH) وتحديدها بواسطة MALDI-MS. (ب) الصفحة التحضيرية للفسفرة الثلاثية لثلاثي النوكليوتيد L-RNA GAA ، مع استئصال نطاق المنتج الرئيسي وتحديده على أنه 5'-triphosphate (ppp) بواسطة ESI-MS. (ج) MALDI-MS لمنتجات تفاعل النفط الخام بعد إزالة الحماية و (د) المنتجات المنقاة من (أ). 5'-ثلاثي الفوسفات (ppp; pppAAA توقع 1,119 Da, لاحظ 1,118 Da; pppCCC توقع 1,047 Da, لاحظ 1,046); يتم تصنيف 5ʹ-diphosphate (pp) و 5ʹ-monophosphate (p) و 5ʹ-hydroxyl (OH) و 5ʹ-H-phosphonate (Hp). (ه) الطيف الكتلي المنزوع الالتواء من الحقن المباشر ESI-MS لمنتج معزول 5'-triphosphate من (B)، مع وضع علامات على قمم محددة (من المتوقع 1,181.6 Da، ولوحظ 1,181.0 Da). كما لوحظت منتجات 5ʹ-diphosphate (pp) ، وكذلك قمم أيون الصوديوم لكل من المنتجات الثلاثية وثنائي الفوسفات (+22 Da). يتم تصنيف قمم الملوثات الشائعة بعلامة نجمية. ولسهولة المقارنة، تم تطبيع أطياف الكتلة إلى أعلى كثافة تقاس في كل طيف ويتم الإبلاغ عنها كنسبة مئوية بالنسبة لتلك القيمة. الاختصارات: PAGE = الرحلان الكهربائي هلام بولي أكريلاميد; MALDI-MS = امتزاز/تأين الليزر بمساعدة المصفوفة؛ ESI-MS = مطياف كتلة التأين بالرش الكهربائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> الشكل 4: تحليل RP-LC من 6 nt و 14 nt D-RNA oligonucleotide triphosphates . (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ و (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. حدد جنبا إلى جنب ESI-MS الذروة الرئيسية لكليهما (~ 70٪) على أنها 5ʹ-triphosphate (ppp) ، مع كميات أقل من 5ʹ-diphosphate (pp). الاختصارات: RP-LC = كروماتوغرافيا سائلة ذات طور عكسي. nt = النيوكليوتيدات; ESI-MS = مطياف كتلة التأين بالرش الكهربائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> الشكل 5: مقارنة بين ركائز أوليغونوكليوتيد 5'-ثلاثي الفوسفات المحضرة عن طريق التوليف الكيميائي أو النسخ في المختبر . (أ) الريبوزيم E ذاتي التكرار يربط الحمض النووي الريبي A و 5′-triphosphorylated RNA B. (B) مقارنة تفاعلات التكرار الذاتي باستخدام 10 μM A و 10 μM B ، إما الاصطناعية (الدوائر المفتوحة) أو المنسوخة في المختبر (الدوائر المملوءة). (ب) كانت البيانات مناسبة لمعادلة النمو اللوجستي: [E] = a / (1 + b e-ct) ، حيث a هي العائد النهائي ، bهي درجة السيني ، و c هي معدل النمو الأسي. كانت معدلات النمو للتفاعلين متطابقة ، عند 1.14 h-1 ، في حين أن المدى النهائي كان أعلى بنسبة 10٪ للتفاعلات مع B الاصطناعية<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> الشكل 6: بلمرة L-RNA عبر الشيرال مع ريبوزيم. (أ) الريبوزيم البوليميراز D-RNA 27.3t ، الذي يحفز الربط المعتمد على القالب ل L-RNA. (ب) يشكل منتج L-RNA الذي تم تصنيعه بواسطة 27.3t جزءا من زخارف إندونوكليز رأس المطرقة. (ج) بلمرة L-RNA التي يتم تحفيزها بواسطة 27.3t باستخدام قالب L-RNA ثنائي الفينيل (بني) ، وتمهيدي L-RNA (أرجواني) ، وأربعة ثلاثي فوسفات ثلاثي النوكليوتيد L-RNA (سماوي) ، يتم إعداده صناعيا. (د) تحليل الصفحة لنواتج التمديد من (ب) في 4 ساعات و 24 ساعة، مع إظهار كل دمج ثلاثي النوكليوتيدات حتى المنتج الكامل الطول (النقطة السوداء). يتم تضمين التمهيدي L-RNA غير المتفاعل كعلامة مرجعية. الاختصارات: PAGE = الرحلان الكهربائي هلام بولي أكريلاميد; M = علامة مرجعية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Oligonucleotide 5′-triphosphates هي مكونات في كل مكان في المسارات البيولوجية الأساسية وشهدت استخداما متزايدا في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. هنا ، نصف تقنيات التوليف الروتيني وتنقية oligonucleotide 5′-triphosphates ، بدءا من oligonucleotides التي أعدتها تقنيات التوليف الآلي القياسية.

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

الفسفرة الثلاثية هي تعديل 5' في كل مكان للحمض النووي الريبي في علم الأحياء ويستخدم بشكل متزايد في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. يتيح البروتوكول الموضح هنا 5'triphosphorylation من أي oligonucleotide المحضرة بواسطة التوليف الآلي القياسي. يعمل الفسفرة الثلاثية الكيميائية على أوليغونوكليوتيدات تحتوي على الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو الحمض النووي غير الطبيعي.هنا ، يتم تصنيع L-RNA الأيسر ثلاثي الفوسفوريلات ، وهو enantiomer من D-RNA البيولوجي ، وتنقيته واستخدامه في تفاعل الريبوسوم. يتم إجراء الفسفرة الثلاثية بعد تخليق أوليغونوكليوتيد الآلي وقبل إزالة الحماية. لا يتم عرض هذه الخطوات هنا ، ولكن يجب أن يكون الباحثون على دراية بالطرق القياسية لكليهما.للبدء ، تأكد من أن مساحة العمل الخاصة بالفسفرة تحتوي على مشعب غاز مع خطين على الأقل والفقاعة متصلة بمصدر أرجون جاف بضغط قابل للتعديل حيث يجب إجراء تفاعل الفسفرة الثلاثية تحت الأرجون. ثم قم بإرفاق محاقن بلاستيكية واحدة بالملليلتر بالخطوط لتسهيل الاتصال بجهاز التفاعل. بعد ذلك ، قم بجمع المعدات بما في ذلك المحاقن البلاستيكية بالملليلتر الواحد ، وسدادة البولي بروبيلين ثلاثية الاتجاهات ، والإبر غير المثبتة ، وأنابيب البولي بروبيلين 1.5 ملليلتر ، وملعقة معدنية صغيرة ، وتخزينها في حاوية مغلقة أو مجفف مع مجفف في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد على الأقل قبل الاستخدام.تحت ضغط الأرجون ، اسحب 30 ملليلتر من الديوكسان اللامائي 1 ، 4 من زجاجة مغلقة. ينقل إلى زجاجة زجاجية مجففة 30 ملليلتر ويضاف مصيدة تجفيف. ختم مع الحاجز المطاطي وتخزينها في مجفف مع المجفف.وبالمثل ، قم بإعداد 30 ملليلتر من N و N-dimethylformamide و acetonitrile وخليط من ثلاثة أجزاء من الديوكسان وجزء واحد من البيريدين حسب الحجم. تحضير محلول TBAP عن طريق خلط بيروفوسفات ثلاثي الألومونيوم الصلب مع ثنائي ميثيل فورماميد وتريبوتيلامين في زجاجة زجاجية سعة 30 ملليلتر كما هو موضح في المخطوطة. أضف ثلاثة مصائد رسم.أغلق الزجاجة بحاجز مطاطي تحت الأرجون وفقاعة مع الأرجون لمدة 30 دقيقة. بعد تحضير أوليغونوكليوتيد مع هيدروكسيل حر 5' على عمود تخليقي باستخدام مركب آلي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي. تحضير الغرفة عن طريق إزالة المكبس من حقنة جافة ملليلتر واحد.اقطع الجزء العلوي من المحقنة باستخدام مقص أو شفرة حلاقة وقم بتوصيل المحقنة بعمود التوليف. في الجزء العلوي من المحقنة ، قم بتوصيل الموقوف ثلاثي الاتجاهات وقم بتوصيل المدخل الجانبي لجهاز التوقف بمصدر الأرجون الجاف باستخدام الفقاعة بحيث يعمل المدخل العلوي لجهاز التوقف كمنفذ حقن الكاشف. قم بتأمين هذا المشغل على حامل مع المشابك وختم جميع مفاصل المنبع بفيلم ختم الشمع.ثم اضبط الموقوف بحيث يتم إغلاق منفذ الحقن ويكون الجهاز مفتوحا لمصدر الأرجون. أغلق الفقاعة واسمح للأرجون عند الضغط المنخفض بالتدفق عبر غرفة العمل لمدة خمس دقائق. بعد إعادة فتح الفقاعة ، قم بإرفاق حقنة بالجزء السفلي من عمود التوليف ، والتي ستكون حقنة النفايات.بعد ذلك ، اسحب الأرجون عبر العمود بشكل متكرر باستخدام حقنة النفايات ثم أعد توصيل المحقنة باستخدام المكبس الذي تم دفعه بالكامل. لإضافة كاشف أو مذيب ، قم بإرفاق إبرة بمصدر الأرجون الجاف وأدخلها في حاجز الكاشف أو زجاجة المذيب ، مع الحرص على عدم غمر الإبرة في محتويات الزجاجة. ثم قم بتجميع حقنة جافة بإبرة وأدخلها في حاجز الكاشف أو زجاجة المذيب دون غمرها في محتويات الزجاجة.بعد ذلك ، املأ المحقنة بالأرجون ، واسحب الإبرة من الحاجز وطرد الأرجون. بعد ملء المحقنة بالأرجون وطردها مرة أخرى ، املأ المحقنة بالحجم المطلوب من المذيب أو الكاشف تحت ضغط الأرجون. اضبط الإيقاف بحيث يتم إغلاق مصدر الأرجون وفتح منفذ الحقن.بمجرد ضبط التوقف على الجهاز بسرعة ، قم بإزالة المحقنة والإبرة المملوءة من الزجاجة المصدر ، وامسح أي مذيب عالق على جانب أو طرف الإبرة ثم أدخل الإبرة في منفذ الحقن. بعد طرد كاشف إلى الغرفة المضادة للمشغلين ، قم بإزالة الإبرة وأغلق منفذ الحقن أثناء إعادة فتح الجهاز إلى مصدر الأرجون. اسحب السائل بلطف من الغرفة المضادة على طول الطريق من خلال عمود التوليف باستخدام حقنة النفايات بحيث يتم الآن الاحتفاظ بكل السائل في حقنة النفايات.الآن ادفع المحلول ببطء مرة أخرى إلى عمود التوليف ، مما يضمن عدم وجود فقاعات غاز في العمود. للخلط أو التحريك ، اسحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل فوق العمود باستخدام حقنة النفايات. لإزالة كاشف أو مذيب من العمود ، اسحب المحلول ببطء إلى حقنة النفايات.بعد مرور الجزء الأكبر من المحلول إلى حقنة النفايات ، اسحب الأرجون لطرد المذيب المتبقي من العمود. بعد ذلك ، قم بإزالة فيلم ختم الشمع حول مفصل حقنة النفايات. ثم قم بإزالة المحقنة وتخلص من محلول النفايات.بعد ذلك ، استبدل حقنة النفايات بحقنة جافة جديدة وأعد إغلاق المفصل. بعد تجميع جهاز الفسفرة الثلاثية ، ابدأ تفاعل الفسفرة الثلاثية بإضافة 200 ميكرولتر من ثنائي أوكسين البيريدين إلى الغرفة المضادة كما هو موضح سابقا. ولكن لا تسحب العينة إلى عمود التوليف بعد.بعد إذابة SalPCl في الديوكسان كما هو موضح في المخطوطة ، أضفه إلى الغرفة المضادة وحمله على عمود التوليف باستخدام حقنة جافة. ثم اتركه يتفاعل لمدة 15 دقيقة ثم قم بإزالة محلول SalPCl والتخلص منه باستخدام حقنة نفايات كما هو موضح سابقا. مباشرة بعد إزالة محلول SalPCl ، أضف 250 ميكرولتر من محلول TBAP إلى الحجرة المضادة وتحميلها على عمود التوليف.دعه يتفاعل لمدة 20 دقيقة مع الإثارة وتجاهل كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، اغسل العمود ب 0.5 ملليلتر من N ، N-dimethylformamide ، ثم 0.5 ملليلتر من الأسيتونيتريل ، وإزالة المذيب بعد كل إضافة. بعد إضافة محلول المؤكسد وإزالته وغسل العمود بالأسيتونيتريل مرة أخرى باستخدام نفس الإجراء الموضح ، قم بتفكيك الجهاز وغسل العمود بخمسة ملليلترات من الأسيتونيتريل.بعد ذلك ، جفف العمود. افصل أوليغونوكليوتيد ثلاثي الفوسفوريلات عن الدعم الصلب وقم بإزالة الحماية باستخدام البروتوكولات القياسية كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، قم بإذابة oligonucleotide المجفف غير المحمي في مخزن مؤقت لتحميل اليوريا ، وتسخينه إلى 80 درجة مئوية ، ثم تحميله على هلام بولي أكريلاميد وتشغيله لمدة ساعة إلى ساعتين عند 25 إلى 35 واط.في نهاية الرحلان الكهربائي للهلام ، بعد إزالة لوحة الجل ، قم بتفكيكها ولف الجل في فيلم بولي فينيل كلوريد. بعد ذلك ، حدد نطاقات المنتج عن طريق التظليل الخلفي بضوء الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر واستقصاء نطاق المنتج الرئيسي باستخدام شفرة حلاقة. سحق الجل المقتطع عن طريق بثقه من خلال حقنة بلاستيكية أو ميكانيكيا.بالنسبة لقلة النوكليوتيدات الأقصر من 15 نيوكليوتيد، قم بالتخلص في ثلاثة أضعاف حجم هلام الماء الحر من النوكليز لمدة 12 ساعة على الأقل مع الإثارة أو الاهتزاز. ثم قم بإزالة قطع الجل الصلبة عن طريق تمرير المحلول عبر حقنة مزودة بمرشح 0.2 ميكرومتر والتركيز عن طريق التجفيد. بعد التركيز ، قم بإزالة الأملاح المتبقية والتحية باستخدام عمود استبعاد الحجم القابل للتصرف وركز عن طريق التجفيد كما هو موضح سابقا.بعد تحضير 10 ميكرولترات من محلول الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على ريبوزيم البوليميراز وقالب L-RNA التمهيدي وثلاثي نيوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتجديده عن طريق تسخينه إلى 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة وتبريده إلى 23 درجة مئوية عند 0.2 درجة مئوية في الثانية في دورة حرارية PCR. بعد احتضان محلول الحمض النووي الريبي عند 17 درجة مئوية، أوقف التفاعل بإضافة 10 ميكرولترات من ضعف تركيز مخزن البداية المخزن المؤقت مع استمرار التفاعل، وخذ 10 ميكرولترات أليكوتس وقم بتبريده بخمسة ميكرولترات من 0.5 مول EDTA عند الرقم الهيدروجيني 8 ومعالجة كل عينة لعزل الحمض النووي الريبي كما هو موضح في المخطوطة. قم بإذابة الحمض النووي الريبي المترسب في 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحميل الجل الرسمي وإعداد التمهيدي غير المتفاعل المسمى بالنهاية كما هو موضح في النص.بمجرد تحضير العينات ، قم بالحرارة إلى 80 درجة مئوية. قم بتحميل خمسة ميكرولترات من العينة في كل بئر وقم بتشغيل الجل عند 40 واط لمدة 40 دقيقة تقريبا. بعد إزالة صفيحة الجل من الحامل ، قم بالمسح الضوئي باستخدام ماسح ضوئي هلام فلورسنت أو فوسفورسنت لتصور منتجات تمديد L-RNA المتقاطعة.بعد تنقية الجل ، يكشف التظليل الخلفي للأشعة فوق البنفسجية عن وجود 5'triphosphate كمنتج رئيسي واحد كما هو موضح لأدوات تشذيب الحمض النووي AAA و CCC و GAA L-RNA trimer. غالبا ما يكون المنتج الجانبي 5'hydroxyl مرئيا كنطاق هجرة أبطأ ، والذي تم عزله وتحديده بواسطة قياس الطيف الكتلي لمشتري الحمض النووي. ترتبط النطاقات الإضافية أثناء تنقية الجل بمنتجات 5'diphosphate و monophosphate و H-phosphonate الجانبية في قياس الطيف الكتلي لمنتجات التفاعل غير النقية.تظهر منتجات 5'triphosphate ذروة كتلة أولية تتوافق مع 5'triphosphate جنبا إلى جنب مع كتل 5'di و monophosphate. تم استخدام ثلاثي النوكليوتيدات L-RNA ذات الصلة كيميائيا مع التمهيدي L-RNA وقالب L-RNA في تفاعل بلمرة الحمض النووي الريبي الذي تم تحليله بواسطة PAGE وتم تصويره باستخدام ماسح ضوئي هلام فلورسنت. أظهر المنتج الموسع الذي تميزت به الدوائر السوداء تخليق نسخة L-RNA من ريبوزيم رأس المطرقة المشفر بواسطة القالب.التعرض للماء أثناء الفسفرة الثلاثية سيقلل من الغلة. اتبع خطوات تحضير الكواشف الجافة وتجميع جهاز التفاعل بعناية. حرك السوائل عبر الجهاز ببطء لتجنب كسر الأختام.الفسفرة الثلاثية الكيميائية ضرورية لإعداد ثلاثي فوسفات الأوليغونوكليوتيد غير البيولوجي، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الأعسر. وقد مكن ذلك من تخليق الريبوزيم عبر الشيرال لإصدارات الصور المرآة لجزيئات الحمض النووي الريبي الموجودة في علم الأحياء.

chemical-triphosphorylation-of-oligonucleotides

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

بروتوكول الموصوفة هنا يهدف إلى شرح وينتقص من العقبات العديدة في طريق المسار المعقدة مما يؤدي إلى triphosphates نوكليوزيد تعديل. بالتالي، هذا البروتوكول يسهل على حد سواء تركيب هذه بناء كتل تنشيط وتوافرها للتطبيقات العملية.

نوكليوزيد Triphosphates - من توليف لتوصيف الكيمياء الحيوية

وتستخدم المقايسات المنافسة الببتيد على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التجارب الجزيئية والمناعية. هذه الورقة تصف طريقة مفصلة لفي المختبر أوليغوببتيد-تنافس فحص كيناز وإجراءات المصادقة المرتبطة بها، والتي قد تكون مفيدة للعثور على مواقع الفسفرة محددة.

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

توفر هذه المقالة إجراء مفصل على التوليف المرحلة الصلبة، وتنقية، وتوصيف دوديكامرز من الحمض النووي الريبي تعديلها في C2'- O -position. وتستخدم الأشعة فوق البنفسجية والدائرية تحلل ضوئي اللون الضوئية لتحديد وتوصيف الجوانب الهيكلية، أي أحادية أو خيوط مزدوجة.

بروتوكول لتجميع المرحلة الصلبة من أوليغوميرس من الحمض النووي الريبي تحتوي على 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiofenylmethyl تعديل وتوصيف عن طريق التعميم ديكرويسم

نحن تقرير البروتوكولات للتوليف وتنقية ليغومرات الببتيد الأحماض النووية (السلطة الفلسطينية) التي تتضمن تعديل للمخلفات. ويرد وصف أساليب البيوكيميائية والفيزيائية لوصف الاعتراف بالجيش الملكي النيبالي الدوبلكس بالمحميات معدلة.

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

البروتينات التي تربط تسلسل معين من الحمض النووي الريبي تلعب أدواراً حاسمة في التعبير الجيني. وصف مفصل لمواقع الربط هذه الأهمية الحاسمة لفهمنا لتنظيم الجينات. ويرد هنا، اتباع نهج خطوة واحدة للطفرات تشبع مواقع ربط البروتين في الجيش الملكي النيبالي. وهذا النهج ذات الصلة لجميع مواقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

نهجاً الطفرات تشبع رواية: وصف خطوة مفردة بروتين تنظيمي ملزم مواقع في الجيش الملكي النيبالي باستخدام فوسفوروثيواتيس

يصف هذا البروتوكول مقايسة غير نشطة لقياس نشاط كيناز من كينازات البولي نوكليوتيد (PNKs) على ركائز الحمض النووي والحمض النووي الريبي الصغيرة.

مُقَسَم غير كهربي لقياس فوسفورية البولي نووكليوتيد من ركائز النيوكليوتيدات الصغيرة

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي ، باستخدام أمثلة على إنزيمات ligase و nuclease و polymerase. يستخدم الفحص قليل النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت وغير المسماة والتي يمكن دمجها لتشكيل دوبلكس تحاكي أضرار الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي أو وسيطة المسار ، مما يسمح بتوصيف سلوك الإنزيم.

استخدام قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي

يوصف نظام ثقافة 3D لتكون الدم باستخدام دم الحبل السري البشري وابيضاض الدم خلايا نخاع العظام. وتستند هذه الطريقة على استخدام مادة البولي يوريثين سقالة الاصطناعية التي يسهل اختراقها المغلفة مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية. هذا سقالة قابل للتكيف لاستيعاب مجموعة واسعة من الخلايا.

خارج الحي تقليد تكون الدم الإنسان العادية وغير العادية

في هذه المقالة نقدم رقاقة ميكروفلويديك لتحليل خلية واحدة. أنه يسمح للالكمي للبروتينات الخلايا، والإنزيمات، العوامل المساعدة، ورسله الثاني عن طريق فحوصات الفلورسنت أو المناعية.

رقاقة ميكروفلويديك للتحليل الكيميائي للخلايا متعددة الاستخدامات واحدة

وتستخدم أجهزة Millifluidic لتخليق رقابة للمواد متناهية الصغر، والتحليل حل وقت آليات التفاعل والحفز المستمر التدفق.

Millifluidics لتخليق المواد الكيميائية والدراسات الميكنة الوقت لحلها

تعلم طريقة كيميائية لثلاثي فسفرة الأوليغونوكليوتيدات باستخدام ساليسيل فوسفوروكلوريديت وبيروفوسفات ثلاثي بوتيل الأمونيوم. تُتيح هذه التقنية تحضير أوليغونوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات ذات تسلسلات متنوعة تشمل L-RNA غير الطبيعي.

الفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات

استكشف المزيد من الفيديوهات