زراعة الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية والتلاعب بها وراثيا

يعد البروتوكول الفعال للحفاظ على الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية وتضخيمها أمرا ضروريا لفهم الأساس الجزيئي لإمراض الديدان الخيطية ومناعة المضيف المضادة للديدان الخيطية. يمكننا هذا البروتوكول من إنتاج عدد كبير من البكتيريا التكافلية والمحورية Heterorhabditis و Steinernema carpocapsae IJs باستخدام مضيف الحشرات ، Galleria mellonella. ابدأ بتغطية طبق بتري بقطعة من ورق الترشيح وأضف ما يقرب من 10 إلى 15 يرقات غاليريا ميلونيلا.

باستخدام ماصة ، قم بتوزيع ملليلترين من الماء يحتوي على حوالي 25 إلى 50 حدثا معديا لكل 10 ميكرولترات من التعليق على ديدان الشمع. وتخزين طبق بتري في خزانة في درجة حرارة الغرفة. اعتمادا على رطوبة ورق الترشيح ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من الماء كل يومين.

عادة ما تموت ديدان الشمع المصابة بالأحداث المعدية في غضون 48 ساعة. قم بإعداد مصائد المياه في وايت بعد حوالي 10 أيام من إصابة ديدان الشمع بالأحداث المعدية. انقل الحشرات الميتة بعناية إلى الجزء غير المنقوع من ورقة الترشيح.

استخدم ماء الصنبور لملء طبق بتري السفلي ووضع غطاء لأنبوب 15 ملليلتر كفاصل للتهوية. استخدم مياه الصنبور بدلا من المياه منزوعة المعادن أو منزوعة الأيونات لتجنب تراكم الديدان الخيطية ، وتأكد من أن مستوى الماء في مصيدة الماء يصل إلى ما يقرب من نصف ارتفاع طبق بتري. عندما يصبح الماء في طبق بتري الصغير غائما بسبب الديدان الخيطية ، استخدم ماصة لنقل الجيل الجديد من الأحداث المعدية إلى قارورة T25 أو T75 لزراعة الخلايا.

في وقت لاحق ، أضف ماء الصنبور بحجم يصل إلى 40٪ أو حتى يتم الوصول إلى الكثافة المناسبة. وتخزين قارورة زراعة الخلايا أفقيا لتجنب احتقان الديدان الخيطية. تكرار نقل الأحداث المعدية إلى قوارير زراعة الخلايا وإضافة الماء حتى يتوقف الأحداث المعدية عن الخروج من جثث الحشرات في غضون ثلاثة إلى خمسة أيام تقريبا.

باستخدام حلقة التلقيح ، قم بكشط عدة رقائق من ثقافة مجمدة من Photorhabdus temperata Ret16 على لوحة MacConkey وخط لمستعمرات واحدة. احتضن الطبق لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 28 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتلقيح 10 ملليلتر من مرق LB مع مستعمرة على MacConkey agar في أنبوب 50 ملليلتر واحتضن الثقافة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية في حاضنة تهتز.

بعد الحضانة ، انقل 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها من أنبوب 50 ملليلتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد ، ثم اغسل 100 من الثقافة بين عشية وضحاها مع 900 ميكرولتر من PBS أحادي القوة عن طريق التميص المركزي ، في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 ملليلتر ، عند 17،900 مرة غرام. ديكان السوبرناتانت. بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافة 10 مرات في PBS أحادي القوة واترك الأنبوب على الجليد.

الآن ، اغمر ديدان الشمع في محلول إيثانول 70٪. بعد تجفيف الحشرات بمنشفة ورقية ، ضعها في أنبوب 50 ملليلتر. ضع الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة لشل حركة ديدان الشمع.

استخدم ورق الترشيح لتغطية النصفين العلوي والسفلي لطبق بتري. استخدم غطاء طبق بتري المغطى بورق الترشيح كدعم أساسي للحقن. رطب في ورقة الترشيح من طبق بتري السفلي ونقله على الجليد لمساعدة ديدان الشمع المحقونة على التعافي.

ماصة 50 ميكرولتر من البكتيريا الباردة المثلجة على قطعة من Parafilm ثم قم بإعداد حقنة إبرة تكرير قياس 22 واضغط على المكبس بلطف لإزالة الهواء عند طرف الإبرة. الحفاظ على دودة الشمع بالقرب من الطرف الخلفي تحت المجسم. حقن الثقافة البكتيرية في الجانب الظهري من الصدر.

يفضل عند التقاطع بين جزأين أسفل البشرة مباشرة موازية لدودة الشمع لتقليل الضرر الداخلي والانتباه إلى كيفية بدء انتفاخ جسم اليرقات. بعد ذلك ، انقل الحشرات المحقونة إلى طبق بتري الانتعاش. وبمجرد حقن جميع الحشرات ووضعها في طبق الاسترداد ، ضع طبق بتري في الظلام.

تستسلم ديدان الشمع بعد يومين من الحقن وتظهر باللون الأحمر بعد حوالي ثلاثة إلى أربعة أيام. ومع ذلك ، تشير الحشرات ذات اللون البني إلى عدوى بكتيرية غير ناجحة. في سبعة أيام بعد الإصابة ، انقل الحشرات ذات اللون الأحمر المميز من الطوب إلى طبق بتري مبطن بورق ترشيح جديد ، وكرر إنتاج الأحداث المعدية للديدان الخيطية التكافلية.

لبدء التعقيم السطحي ، قم بجمع ما يكفي من البكتيريا التكافلية ، والتهاب الهيتيرورابيدات ، والأحداث المعدية المحورية المرشحة عن طريق الطرد المركزي. لصنع حبيبة في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر ، أضف 500 ميكرولتر من المبيض بنسبة 5٪ إلى الكريات في كل أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق وعكس الأنبوب. بعد الحضانة لمدة 10 دقائق ، جهاز طرد مركزي في 17،900 مرة غرام لمدة دقيقة واحدة وإزالة supernatant.

ثم اغسل الكريات بملليلتر واحد من الماء المعقم. الطرد المركزي ، وإزالة supernatant وتكرار هذا الإجراء أربع مرات أخرى. يوضح الرسم البياني نتائج تقييم حالة الديدان الخيطية البكتيرية البكتيرية التي مرت بمرحلة الأكسين.

حمل التهاب البكتيريا غير المتجانسة من مزرعة الأسهم خلايا Photorhabdus luminescens التكافلية. ومع ذلك ، كانت الديدان الخيطية الخالية من بكتيريا Photorhabdus luminescens المرتبطة بها أكسينية. للحفاظ على قابلية تكرار تجربتك ، قم دائما بسحب طازج من ثقافة المخزون البكتيري من مستعمرة جديدة وأخرج الثقافة بين عشية وضحاها قبل أن تصل إلى وجه ثابت.

استخدم فقط دودة شمع غاليريا الحمراء من الطوب لفخ الماء في وايت وتخلص من الباقي. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام الديدان الخيطية للتحقيق في التفاعل مع الجهاز المناعي للحشرات. تمهد هذه التقنية الطريق للباحث لاستكشاف الأساس الجزيئي للتطفل الخيطي والمناعة المضيفة المضادة للديدان الخيطية.