من أسفل إلى أعلى في طرق المختبر لفحص التنظيم فوق الهيكلي ، وإعادة تشكيل الغشاء ، وسلوك حساسية الانحناء للسبتين

باستخدام هذا البروتوكول ، تصورنا تنظيم البروتينات الخيطية الهيكلية الخلوية على ركائز نمطية تعرض انحناءات مختلفة. يمكننا اختبار حساسية الانحناء. دقة صور المجهر الإلكتروني الماسح عالية بما فيه الكفاية بحيث يتم تصور منظمات مقياس النانومتر.

الطرق التي نستخدمها للتثبيت خفيفة بما يكفي للحفاظ على التنظيم الهيكلي للبروتين. يبقى هذا في نطاق البحث الأساسي لفهم سلوك خيوط الهيكل الخلوي. ابدأ بتصميم مادة لاصقة بصرية متموجة من Norland ، أو نسخة طبق الأصل من NOA ، في بيئة غرفة نظيفة من أنماط متموجة متموجة من polydimethylsiloxane بسعة 250 نانومتر ودورية جانبية ميكرومترية.

للقيام بذلك ، قم بإيداع خمسة ميكرولترات من NOA السائل على زلة غطاء زجاجي دائري قطرها سنتيمتر واحد ثم ضع قالب PDMS على القطرة. عالج المجموعة بضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 320 نانومتر لمدة خمس دقائق لإضفاء البلمرة الضوئية على السائل NOA إلى فيلم بوليمر رقيق. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قشر بلطف قالب PDMS من زلة الغطاء باستخدام NOA المبلمر الطازج.

عالج فيلم NOA باستخدام منظف بلازما الهواء لمدة خمس دقائق لجعل السطح محب للماء. قم بإعداد محلول من حويصلات أحادية الصفيحة الصغيرة ، أو سيارات الدفع الرباعي ، كما هو موضح في المخطوطة ، والحصول على سيارات الدفع الرباعي عن طريق تعليق فيلم دهني مجفف في مخزن المراقبة العازل تحت الصوتنة في سونيكتور الحمام لمدة خمس إلى 10 دقائق حتى يصبح المحلول شفافا. في وقت لاحق ، أدخل زلات الغطاء التي تدعم أنماط NOA داخل آبار صناديق زراعة الخلايا واحتضن أنماط NOA المفرغة حديثا مع 100 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من محلول SUV ملليلتر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتوليد طبقة ثنائية الدهون المدعومة.

لإزالة سيارة الدفع الرباعي غير المنصهرة، اشطف الجانبين جيدا ست مرات باستخدام المخزن المؤقت منخفض الملح للسبتين دون ترك العينة تجف تماما بين غسلتين. قم بتخفيف محلول مخزون السيتين الثماني في مخزن مؤقت منخفض الملح للسبتين إلى تركيزات نهائية ، تتراوح من 10 إلى 100 نانومولير وأحجام ملليلتر واحد. ثم ، احتضن محلول البروتين على الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل شرائح NOA التي تحتوي على طبقات ثنائية الدهون المدعومة المنصهرة واحتضان البروتين باستخدام مخزن مؤقت منخفض الملح من السيبتين. استبدل المخزن المؤقت منخفض الملح بمحلول تثبيت غلوتارالدهيد بنسبة 2٪ في مخزن كاكوديليت الصوديوم المولي 0.1 ، المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية ، واترك التفاعل يستمر لمدة 15 دقيقة ، واغسل العينة الثابتة ثلاث مرات ، خمس دقائق لكل منها مع 0.1 كاكوديلات الصوديوم المولي. بعد الغسيل ، احتضن العينة في محلول مثبت من رابع أكسيد الأوزميوم ، ثم حمض التانيك المصفى ، وأخيرا خلات اليورانيل المصفاة لمدة 10 دقائق لكل منهما.

اغسل العينة ثلاث مرات في الماء المقطر بعد كل محلول. احتضان العينة بشكل متسلسل في محاليل الإيثانول بدءا من 50٪ إلى 100٪ لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لكل منهما. انقل الشرائح الزجاجية داخل مجفف النقطة الحرجة المليء مسبقا بالإيثانول واتبع تعليمات الشركة المصنعة للتجفيف.

نظرا لأن العينات المجففة مائية للغاية ، فقم بتغطيتها على الفور عن طريق إرفاق الغطاء بالكعب. ثم أضف شريطا من الطلاء الفضي إلى الوجه العلوي لانزلاق الغطاء دون إنشاء تكتلات الطلاء. تأكد من أن الاتصال مع كعب مرضية.

عندما تتبخر العينة تماما ، استخدم جهازا مجهزا برأس بلازما مغناطيسي متقطع ومرحلة كوكبية دوارة ، واتبع البروتوكولات القياسية التي تقدمها الشركة المصنعة. قم بإجراء الرش المسبق عند 120 مللي أمبير لمدة 60 ثانية لإزالة طبقة الأكسيد على السطح. ثم إيداع 1.5 نانومتر من التنغستن مع شاشة سمك الفيلم عند 90 مللي أمبير ومسافة عمل تبلغ 50 ملليلتر.

في وقت لاحق ، قم بتخزين العينات تحت فراغ لحمايتها من الهواء المحيط حتى وطوال تحليلات SEM. لتحقيق تصوير عالي المحلول عن طريق الكشف عن الإلكترونات الثانوية باستخدام الكاشف الداخلي ، اضبط الجهد المتسارع على ثلاثة كيلوفولت وتيار الحزمة على فتحة 20 ميكرومتر. بالنسبة للملاحظات، استخدم دقة تتراوح بين 21.25 نانومتر لكل بكسل و1.224 نانومتر لكل بكسل.

استخدم دقة 5.58 نانومتر لكل بكسل لتحليل البيانات. اضبط مسافة العمل بين ملليمتر واحد إلى مليمترين للمراقبة عالية الدقة وحوالي ثلاثة ملليمترات إذا كانت هناك حاجة إلى زيادة عمق المجال. اضبط سرعة المسح الضوئي وتكامل الخط باستمرار لضمان نسبة إشارة ثابتة إلى الضوضاء مع وقت اكتساب يتراوح بين 30 و45 ثانية لكل صورة.

يوضح التحليل التمثيلي تأثير المواد المودعة على خيوط السيتين على أنماط PDMS المتموجة مع 1.5 نانومتر من البلاتين و 1.5 نانومتر من التنغستن. لوحظ أن الحويصلات العملاقة العارية أحادية الصفيحة ، أو GUVs ، كانت كروية تماما. بعد التشوه الناجم عن السبعين ، ظهرت الحويصلات ذات أوجه وظلت التشوهات ثابتة ، وبالتالي لم تتقلب.

في تركيزات أعلى من septins ، لوحظت تشوهات دورية في الحويصلات. تم فحص التجميع الذاتي لخيوط septin المرتبطة بحويصلات أحادية الصفيحة الكبيرة ، أو LUVs ، باستخدام صورة مجهر إلكتروني مبرد وتم الحصول على إعادة بناء 3D من سلسلة مائلة. تم تصور الترتيب المعتمد على الانحناء لخيوط السيتين بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح.

عند التكبير المنخفض ، كان هناك نمط متموج مع دورية الانحناءات السلبية والإيجابية مرئية. تم النظر إلى التنظيم الهيكلي الفائق لخيوط السيبتين بتكبير أعلى. يجب تقشير NOA بلطف لمنع التدهور.

بعد التصوير ، يمكن إجراء بعض تحليل الصور لتحديد ميزات البنية الفائقة التي تصورها SCM ، مثل تباعد الخيوط ، واتجاه الخيوط. تم تطبيق الطريقة الحالية على السيبتين ، ولكن يمكن استخدامها أيضا للبروتينات أو البروتينات الهيكلية الخلوية الأخرى التي تنظم خيوط طويلة وبالتالي تكون حساسة للانحناء.