استخدام الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري لدراسة ديناميكيات تجميع خيوط وحزم الأكتين المفردة

نحن نجمع بين الفحص المجهري الفلوري والموائع الدقيقة لدراسة كيفية تنظيم البروتينات المرتبطة بالأكتين لتجميع خيوط الأكتين وتفكيكها. باستخدام الموائع الدقيقة ، نحن قادرون على تحديد التفاعلات التي تحدث على عشرات خيوط الأكتين الفردية في وقت واحد ، مع التحكم بدقة في الظروف الكيميائية الحيوية والميكانيكية. تذكر أن المحاليل يتم حقنها أولا بالتوازي حتى تصل إلى الغرفة ، وبعد ذلك ، يتم تعريض الخيوط بالتتابع لكل محلول عن طريق تغيير إعداد الضغط.

لبدء إعداد polydimethylsiloxane ، أو PDMS ، تجميع الغرفة ، قم بتسخين الصفيحة الساخنة إلى 100 درجة مئوية. قم بتعريض غرفة PDMS نظيفة وغطاء زجاجي واحد ينزلق في طبق بتري نظيف للأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في منظف عميق للأشعة فوق البنفسجية. عند الانتهاء ، ضع غرفة PDMS فوق الغطاء بحيث يتم وضع السطحين المعرضين مباشرة للأشعة فوق البنفسجية على اتصال.

لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة في واجهة انزلاق غطاء PDMS ، اضغط برفق على سطح الغرفة بإصبع. اضغط بقوة على الزوايا والجوانب ، مما يضمن عدم ملامسة سقف الغرفة للسطح الزجاجي. ضع الغرفة مع الجزء السفلي الزجاجي المواجه للصفيحة الساخنة عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم استخدم الغرفة على الفور ، أو قم بتخزينها في طبق بتري نظيف لمدة أسبوع. لشطف أنبوب المدخل والمخرج ، املأ أنبوب خزان واحد سعة 2 ملليلتر ب 300 ميكرولتر من F-buffer ، وقم بتثبيته على حامل الموائع الدقيقة ، واضبط الضغط على 300 ملليبار. دع خمس إلى ثماني قطرات من F-buffer تضيع هباء، ثم اضبط الضغط على الصفر وكرر الإجراء لكل قناة.

بعد ذلك ، اضبط الضغط على المخرج على أنبوب الخزان من أربعة إلى 50 مللي بار ، بمجرد خروج قطرة من طرف الأنابيب ، قم بتوصيل الأنبوب بمخرج غرفة PDMS. عندما يملأ السائل الغرفة ويخرج من جميع المداخل ، اضبط ضغط المخرج على 20 ملليبار. في وقت لاحق ، اضبط الضغط على أنبوب الخزان إلى 1 إلى 50 ملليبار.

لتجنب إدخال فقاعات الهواء ، تأكد من خروج قطرة من الأنبوب ومدخل PDMS قبل توصيل الأنبوب بمدخل واحد. اضبط ضغط المدخل على 30 مللي بار. بعد توصيل المدخلين اثنين وثلاثة كما هو موضح ، اضبط ضغط جميع المداخل على 20 ملليبار ، وضغط المخرج على صفر ملليبار.

تأكد من أن معدلات التدفق في المداخل متساوية تقريبا. عند تغيير الخزان ، اضبط جميع ضغوط المدخل على 12 مللي بار وضغط المخرج على 5 ملليبار. لحقن محلول بسرعة ، اضبط ضغط المدخل المقابل على 150 مللي بار ، واضبط الضغط في المداخل الأخرى على حوالي 100 مللي بار ، بحيث يكون معدل التدفق الناتج في المداخل 500 نانولتر في الدقيقة.

لتغيير المحلول ، املأ 200 إلى 300 ميكرولتر من المحلول في أنبوب خزان جديد واضبط الضغط على إعداد التغيير. ثم ، قم بفك أنبوب خزان المدخل. بمجرد تشكيل قطرة صغيرة عند طرف الأنابيب ، قم بالمسمار في الأنبوب الجديد باستخدام المحلول الطازج ، وقم بتغيير إعداد الضغط إلى تدفق عال.

اعتمادا على تكوين الموائع الدقيقة وهندسة الغرفة ، انتظر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى يملأ المحلول الأنابيب ويصل إلى الغرفة. يمكن اتباع العملية عن طريق قياس الزيادة في التألق بمرور الوقت. من أجل تشغيل السطح ، قم بتغيير المحلول من ثلاثة إلى 200 ميكرولتر من 50 بذرة بيكومولار الطيفية الأكتين في F-buffer ، وحقن المحلول لمدة دقيقتين مع تدفق عالي ثلاثة.

بالنسبة للتخميل السطحي ، قم بتغيير الأنبوب الثالث مع 300 ميكرولتر من 5٪ BSA في F-buffer ، ثم حقن لمدة خمس دقائق عند تدفق عال ثلاثة ، تليها خمس دقائق في منتصف التدفق ثلاثة ، مع انخفاض الضغط من سبعة إلى ثمانية ملليبار في القناتين الأولى والثانية للحصول على تدفق مضاد من 100 نانولتر في الدقيقة. سيتم تخميل سطح الغرفة بالكامل BSA. قم بتغيير الأنبوب الثالث إلى F-buffer لشطف القناة لمدة خمس دقائق عند التدفق العالي ثلاثة.

في وقت لاحق ، قم بتغيير الأنابيب من واحد إلى ثلاثة باستخدام بروفيلين أكتين ميكرومولار واحد ، و 0.15 ميكرومولار أكتين ، و F buffer ، على التوالي ، كما هو موضح في المخطوطة ، وحقن المحاليل المعدة حديثا باستخدام التدفق العالي وكلها محددة مسبقا لمدة ثلاث إلى أربع دقائق. قم بتشغيل المجهر واضبط وقت التعرض للكاميرا على 100 إلى 200 مللي ثانية ، وليزر الإثارة إلى 10 إلى 20٪ من الطاقة ، وإجمالي تألق الانعكاس الداخلي ، أو عمق TIRF ، عند 200 إلى 300 نانومتر لالتقاط الصور بهدف 60X. بعد ذلك ، اضبط إعداد الضغط على متوسط التدفق لمدة 10 دقائق لتسجيل بلمرة الخيوط بمعدل إطار واحد كل 20 ثانية ، يليه منتصف التدفق اثنان لمدة 15 دقيقة لشيخوخة الخيوط.

التقط إزالة البلمرة في وضع التألق عند إطار واحد كل خمس ثوان ، بعد إطار واحد إلى إطارين ، وانتقل إلى منتصف التدفق ثلاثة لتسجيل خيوط إزالة البلمرة عند حوالي 10 وحدات فرعية في الثانية. لإعادة ضبط التجربة ، قم بكسر جميع الخيوط المصنفة بالفلورسنت عن طريق تعريضها باستمرار لليزر بأقصى طاقة لمدة دقيقتين. اختبر ظروفا مختلفة عن طريق تغيير المحاليل واحد أو اثنين أو ثلاثة وحقنها بتدفق عال لمدة ثلاث إلى أربع دقائق.

يتم عرض نتائج تجربة البلمرة / إزالة البلمرة الأساسية هنا. تم استخدام الكيموجراف الناتج لتحديد معدلات البلمرة وإزالة البلمرة كميا. عندما تعرضت خيوط الأكتين المزروعة لمحلول cofilin المسمى بالفلورسنت ، تم نوى مجموعات cofilin ونمت نحو النهايات المدببة والشائكة.

عندما تتعرض خيوط مفردة للفشن فإنها تشكل حزم تبدو أكثر إشراقا ولا تتماشى تماما مع التدفق. من المهم جدا تجنب إدخال فقاعات الهواء في النظام عند تغيير الأنابيب والانتباه إلى عدم إفراغ أنابيب الخزان. كانت هذه التقنية حاسمة لتطبيق قوى السحب على عشرات الخيوط المفردة ، والنظر في الحساسية الميكانيكية للفورمين والكوفيلين ، وإزالة التفرع ARP2/3.