كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر

يعد تحويل الحمض النووي البلازميدي بالكهرباء إلى العضلات الهيكلية طريقة قابلة للتطبيق لتعديل التعبير الجيني دون المساس بانقباض العضلات لدى الفئران.

يعد نقل الجينات بوساطة الكهربية في العضلات تقنية سهلة وفعالة للتحقيق في التغيرات في فسيولوجيا العضلات. وجدنا أن الكهربية لا تضر بانقباض العضلات. إن التركيب الكهربائي للجينات في العضلات في الجسم الحي هو إجراء بسيط وفعال لا يتطلب تعبئة أكثر شمولا للبنى الجينية في ناقلات فيروسية.

من الصعب تصور مؤسسة كهرباء لبنان وعزلها وحقنها بسبب موقعها وصغر حجمها. قد تساعد الممارسة على جثة الفأر وحقن الحبر البيولوجي مثل حبر الهند في تقديم دليل على الحقن الكافي. سيوضح الإجراء براين هاين ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري.

قبل حقن الفأر ، تأكد من المستوى الجراحي للتخدير باستخدام ملقط مع عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم ، ثم انقل الماوس إلى مخروط الأنف الذي يستريح على صفيحة ماء متداولة عند 37 درجة مئوية لبقية الإجراء. بمجرد وضع الماوس في وضع ضعيف ، قم بإزالة الشعر من كلا الطرفين الخلفيين باستخدام ماكينات قص الشعر الصغيرة ، ثم قم بتعقيم منطقة الحقن بالتناوب بنسبة 70٪ من الإيثانول والبيتادين. بالنسبة للحقن ، حدد موقع الظنبوب الأمامي أو وتر TA المرئي من خلال الجلد على الجانب الجانبي من أسفل الساق وحدد الطرف العلوي من عضلة TA.

ثم أدخل إبرة قياس 30 مثبتة على حقنة صغيرة سعة 50 ميكرولتر في العضلات بزاوية خمس درجات ضحلة من واحد إلى مليمترين أعلى من الوصلة العضلية حتى تصل الإبرة إلى الطرف العلوي من العضلات. قم بخفض المكبس أثناء سحب الإبرة ببطء على طول مسار الحقن لتوصيل 50 ميكرولتر من محلول البلازميد إلى العضلات. يجب أن تنتفخ العضلات.

اضبط المؤقت لمدة دقيقة واحدة وقم بقياس سمك الساق في عضلة TA ، ثم اضبط أقطاب الفرجار على السماكة المقاسة. ثم اضبط الجهد الكهربائي على 12.5 فولت لكل ملليمتر. بعد دقيقة واحدة ، ضع أقطاب الفرجار الكهربائية عن كثب حول الطرف السفلي دون أن تكون مشدودة بشكل مفرط لتقديم خمس نبضات موجة مربعة لمدة 20 مللي ثانية وفترات 200 مللي ثانية.

يجب أن ترتعش العضلات مع كل نبضة. كرر الإجراء مع الطرف الآخر باستخدام ناقل بلازميد التحكم. عند الانتهاء، قم بإزالة الماوس من مخروط الأنف واسمح للماوس بالتعافي على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية.

بمجرد استردادها ، أعد الماوس إلى قفصه. مع وجود الماوس في وضع ضعيف ، حدد موقع قمة عظم الساق الأمامية بصريا ومن خلال خفقان لطيف. استخدم مشرطا لإجراء شق ضحل عبر الجلد على الجانب الجانبي من قمة الساق الأمامية التي تقل بمقدار خمسة ملليمترات عن الركبة إلى مليمترين أعلى من الوصلة العضلية TA.

بمساعدة مقص صغير ، قم بتشريح اللفافة بصراحة ، وكشف عضلة TA ، ثم فصل عضلة TA عن الساق بلطف عن طريق سحب العضلة للكشف عن الباسطة الرقمية الطويلة أو EDL. حافظ على TA واضحا من EDL أثناء الإجراء باستخدام ملقط منحني صغير. أدخل الإبرة ذات المقياس 30 في EDL طوليا حتى تصل الإبرة إلى الطرف العلوي للعضلة وحقن 10 ميكرولترات من محلول البلازميد كما هو موضح من قبل.

يجب أن تنتفخ عضلة EDL. قم بقياس سمك الساق في EDL واضبط أقطاب الفرجار على السماكة المقاسة لتقديم خمس نبضات موجة مربعة كما هو موضح سابقا. عند الانتهاء من ذلك ، أغلق الشق باستخدام خيوط نايلون غير قابلة للامتصاص يمكن التخلص منها 4-0.

قم لاحقا بإزالة الماوس من مخروط الأنف واسمح له بالتعافي على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. إعطاء مسكن مناسب تحت الجلد مباشرة بعد الجراحة وبعد 12 إلى 24 ساعة من الجراحة. بمجرد استردادها ، أعد الماوس إلى القفص المنزلي.

بعد الحقن والكهربية لبلازميد pcDNA3-EGFP في عضلات TA و EDL ، لوحظ تعبير GFP يشير إلى امتصاص الحمض النووي في ألياف العضلات. عند تصويرها بتكبير أقل ، يمكن تصور كفاءة نقل العضلات EDL من خلال ظهور الألياف الخضراء مقابل الألياف السوداء. كان ل EDLs المحقونة والكهربائية استجابات تيتانيك مماثلة عند 100 هرتز مقارنة بالعضلات غير المحقونة أو الكهربية الضابطة.

لم يتم المساس ب EDL المحقون والكهربائي ، وقوة العضلات الكزازية ، وقوة العضلات الكزازية المحددة ، والوقت اللازم لذروة التوتر ، ونصف وقت الاسترخاء مقارنة بالتحكم الذي لم يمسه أحد. من المهم تحديد العضلات المراد حقنها بدقة وتقديم محلول البلازميد بكفاءة. يمكن إجراء عدد من القياسات النسيجية والكيميائية الحيوية باستخدام هذا البروتوكول.

يمكن إجراء توطين الخلايا المستهدفة للبروتين ، وضربة قاضية للجين المستهدف ، ومراسلي النسخ ، ومجموعة من تلطيخ الأنسجة. تم استخدام هذه التقنية لتحديد مجموعة واسعة من التغييرات في الإشارات الجزيئية في العضلات خلال الظروف الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية. التحقيق في انقباض العضلات بعد نقل الجينات ممكن باستخدام هذه التقنية.