أدوات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية على المستوى الخلوي

باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة المقدمة ، يمكننا فحص التفاعلات الديناميكية بين الفطريات والميكروبات الأخرى مع التحكم المكاني والبيئي الدقيق ، بالإضافة إلى التصوير عالي الدقة على مستوى الخلية الواحدة. الأهم من ذلك ، يمكن حصر النمو الفطري وتوجيهه داخل قناة الموائع الدقيقة. تمكين الحصول على صور بفاصل زمني عالي الجودة.

لذلك ، يمكن استكشاف تعقيدات التفاعلات الفطرية والفطرية والبكتيرية. يعد فهم التفاعلات الميكروبية الفطرية خطوة أساسية في تحديد ميكروبيوم التربة والحفاظ عليه. ويمكن استغلال هذه المعرفة لتطوير عوامل جديدة للمكافحة البيولوجية مع الزراعة المستدامة.

للبدء ، قم بإعداد ما يقرب من 40 جراما من poly (dimethylsiloxane) أو PDMs ، عن طريق خلط القاعدة وعامل المعالجة جيدا بنسبة 10 إلى 1 باستخدام ملعقة في كوب بلاستيكي نظيف. لإزالة جميع فقاعات الهواء ، ضع الكوب في غرفة فراغ لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، باستخدام شريط شفاف ، قم بتأمين القالب الرئيسي في حامل بلاستيكي واستخدم الهواء المصفى المضغوط لإزالة أي جزيئات غبار ، ثم صب PDMs على وسط القالب الرئيسي والسماح له بالاستقرار.

لمنع ترسب جزيئات الغبار على سطح PDMs ، قم بتغطية القالب الرئيسي بشكل فضفاض بغطاء بلاستيكي ، ثم انقل القالب الرئيسي إلى فرن وقم بمعالجته بين عشية وضحاها عند 70 درجة مئوية. بعد إزالة القالب الرئيسي من الفرن والسماح له بالبرودة ، قشر PDMs المعالجة بعيدا عن القالب الرئيسي والإطار البلاستيكي دون إتلاف القالب الرئيسي في PDMs. ثم للحفاظ على سطح خال من الغبار ، ضع شريطا شفافا فوق القنوات الدقيقة المنقوشة في PDMs.

بعد ذلك ، استخدم مقصلة مثبتة أو شفرة حلاقة لقطع PDMs إلى ألواح على النحو المحدد في التصميم. عند قطع الفتحة الجانبية للوح PDMs المستخدم في جهاز التفاعل البكتيري الفطري ، أو جهاز BFI ، تأكد من أن القنوات الدقيقة مفتوحة بالكامل. ومع ذلك ، بالنسبة لألواح PDMs المستخدمة في تجميع جهاز التفاعل الفطري الفطري ، أو FFI ، يجب تقليم كل زاوية بحيث تتناسب مع طبق Petri ذي القاع الزجاجي.

بعد ذلك ، استخدم قاطعا دقيقا لثقب ثقوب المدخل أو المخرج وفقا لتصميم الجهاز. بعد ذلك ، قم بغمر ألواح PDMs في محلول هيدروكسيد الصوديوم المولي 0.5. شطف الألواح في الماء المقطر المزدوج المعقم قبل نقلها إلى محلول الإيثانول 70٪.

بعد إزالة الإيثانول وشطف الألواح بالماء المعقم المقطر المزدوج مرة أخرى ، اغمر الألواح في ماء مقطر مزدوج معقم وسونيكات لمدة خمس دقائق ، ثم أزل لوح PDMs من الماء ، وجففها بالهواء المصفى المضغوط ، وضعها في طبق بتري مربع معقم. بعد ذلك ، احتضن طبق بتري مع لوح PDMs في فرن عند 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بمجرد أن تبرد الألواح في بيئة خالية من الغبار ، قم بإزالة أي غبار من سطحها باستخدام الشريط والهواء المصفى المضغوط.

لتنشيط أسطح ألواح PDMs وأطباق Petri ذات القاع الزجاجي ، والتي سيتم ربطها لاحقا معا ، ضعها في منظف بلازما مع تنشيط الأسطح لأعلى. بعد إزالة لوح PDMs في أطباق Petri من منظف البلازما ، قم بربطها بلطف عن طريق وضع الأسطح المنشطة في اتصال مطابق مع بعضها البعض. Bond BFI و FFI PDMs بلاطة مع أطباق بتري بأقطار 35 ملم و 55 ملم ، على التوالي للتحقق من الترابط الناجح ، في محاولة لسحب مختبر PDMs من طبق بتري مع ملاقط.

تصور الجهاز بعناية بالعين أو بواسطة الفحص المجهري العام لضمان عدم انهيار مداخل التلقيح أو القنوات الدقيقة. بالنسبة للظروف المشبعة بالماء أو الغنية بالمغذيات ، قم بماصة 100 ميكرولتر من المحلول المطلوب لملء أجهزة BFI مباشرة بعد الترابط. بالنسبة لأجهزة FFI ، أضف 30 ميكرولتر من الوسائط إلى كل مدخل.

أخيرا ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم إلى طبق بتري للحفاظ على الرطوبة. ومع ذلك ، بالنسبة للظروف غير المشبعة بالماء ، ما عليك سوى إضافة 100 إلى 200 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم إلى طبق بتري للحفاظ على الرطوبة. بالنسبة للتلقيح الفطري ، داخل غطاء تدفق صفائحي ، باستخدام حفار فلين معقم ، قم بإزالة قابس أجار من مستعمرة على محيط ثقافة عمرها ثلاثة أيام ، مما يضمن الحفاظ على جبهة hyphal المتنامية سليمة.

ثم أدخل قابس الأجار في المدخل الفطري لجهاز BFI و / أو FFI مع جانب الميسيليوم لأسفل في جبهة hyphal الموجهة نحو فتحات القنوات الدقيقة لتشجيع تسلل hyphal للقنوات. بالنسبة لجهاز FFI ، أدخل قابس أجار آخر مع نوع فطري ثان في المدخل المقابل. بعد ذلك ، قم بإغلاق طبق بتري بفيلم شفاف واحتضنه عند 25 إلى 28 درجة مئوية في الظلام حتى التصوير.

للتلقيح البكتيري ، بعد إزالة جهاز BFI من الحاضنة ، ماصة 10 ميكرولتر من تعليق بكتيري في المدخل البكتيري في بيئة معقمة. بمجرد إغلاق طبق بتري بفيلم شفاف ، قم بتخزين الجهاز في وضع مستقيم عند 25 درجة مئوية في الظلام حتى يبدأ التصوير. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تصور التفاعل بين الفطر Coprinopsis cinerea وبكتيريا Bacillus subtilis بنجاح.

لوحظ أنه في وجود البكتيريا ، بدأ معدل نمو الفطريات في الانخفاض بشكل كبير بعد حوالي خمس ساعات من التلقيح المعدني. علاوة على ذلك ، كان لل hyphae الفطرية المرتبطة بالبكتيريا مظهر رقيق وشفاف. كما كشف الفحص المجهري الفلوري بالفاصل الزمني عن انهيار الهيفاي الفطري بعد خمس ساعات من التلقيح المشترك باستخدام Bacillus subtilis.

ومع ذلك ، من ست ساعات فصاعدا ، بدأ عدد البكتيريا أيضا في الانخفاض. أظهر تصور التفاعلات الفطرية الفطرية أن Fusarium graminearum يمنع بقوة نمو Trichoderma rossicum ، والذي كان واضحا باستخدام المجهر الفلوري. كما كشف هذا البروتوكول عن تغيرات مورفولوجية كبيرة في فطر Verticillium longisporum في وجود بكتيريا Pseudomonas synxantha و Pseudomonas fluorescens.

كما كشفت تقنية التصوير الديناميكي عالية الدقة المستخدمة في الدراسة عن تكوين الحاجز في Fusarium graminearum في وجود الفطر Clonostachys rosea. أتاح وضع العلامات الفلورية التحديد الكمي الديناميكي لانتشار الواصلة الوردية Clonostachys في جهاز FFI. يمكن للمستخدم تكييف هذه الأجهزة وتعديلها لدمج أنواع مختلفة من الاهتمام ومعالجة أسئلتها التجريبية المحددة المتعلقة بالتفاعلات الميكروبية الفطرية.

وقد تجاوزت كل من أجهزة BFI و FFI الحدود العلمية ، وكشفت عن كيفية نشر الفطريات لإشارات الدفاع والمواد المغذية عند هجوم الفطريات والفيروسات والديدان الخيطية وتمكين التحقيقات في انتشار البكتيريا.