تحديد تقارب الارتباط (K_D) للأجسام المضادة ذات العلامات المشعة للمستضدات المجمدة

يمكن لهذه الطريقة تحديد التقارب الملزم للجسم المضاد الموسوم إشعاعيا لمستضده. وسوف يقيس أيضا خصوصية الربط. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة البسيطة هي التوصيف المحدد للتقارب الملزم للجسم المضاد المشع فقط دون تدخل من الجسم المضاد الأبوي غير المقترن.

تتحقق هذه التقنية كميا من قدرة الجسم المضاد الموسوم إشعاعيا على الارتباط بهدفه. هذا مهم للتطبيقات في التصوير النووي وفي العلاج النووي في مجموعة متنوعة من الأمراض. ستوضح الإجراء إريكا بيليتزكي ، وهي زميلة دراسات عليا من مختبري.

للبدء ، قم بإعداد مخزن مؤقت للتجميد بإضافة 191 ملليغرام من بيكربونات الصوديوم و 23.9 ملليغرام من كربونات الصوديوم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. ثم ، أضف 40 ملليلتر من الماء 18 ميجا أوم وتذوب عن طريق الدوامة. الآن ، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.0 قبل رفع الحجم الإجمالي إلى 50 ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بإعداد 200 ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت عن طريق إضافة 200 ملليلتر من PBS و 100 ميكرولتر من Tween 20 إلى زجاجة 250 ملليلتر. قم أيضا بإعداد 50 ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم عن طريق إضافة 50 ملليغرام من BSA و 25 ميكرولتر من Tween 20 إلى 50 ملليلتر من PBS واخلطها عن طريق الدوامة. أضف 1.5 جرام من BSA إلى 50 ملليلتر من PBS لإعداد المخزن المؤقت للحجب والدوامة بلطف للخلط.

تمييع المستضد في المخزن المؤقت للتجميد. ثم خذ صفيحة قابلة للكسر ، 96 بئرا ، مسطحة القاع وأضف 100 ميكرولتر من المستضد إلى قاع كل بئر من 24 بئرا في مصفوفة ثمانية في ثلاثة. غطي اللوحة بشريط مانع للتسرب واحتضنها عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت للغسيل. اقلب اللوحة بسرعة في الحوض للتخلص من السائل واضغط على اللوحة على كومة من المناشف الورقية لإزالة السائل الزائد. ثم ، إلى الآبار التي تحتوي على المستضد ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل العازل لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.

أضف 300 ميكرولتر من العازل المانع لكل بئر إلى كل من 24 بئرا مغلفة بالمستضدات و 24 بئرا فارغة من الصفيحة المكونة من 96 بئرا. ثم ، احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة في درجة الحرارة المحيطة واغسل كل بئر من الطبق ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من الغسيل المؤقت. قم بعمل تخفيفات تسلسلية ثلاثية الأضعاف للجسم المضاد الموسوم إشعاعيا في المخزن المؤقت الملزم لثمانية صفوف مخصصة من A إلى H على اللوحة.

أولا ، احسب حجم الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية اللازمة لصنع محلول 1.2 ملليلتر من التركيز الأول. ثم ، أضف 800 ميكرولتر من العازلة الملزمة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المسماة B إلى H وأضف الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للربط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى A.أضف الحجم المحسوب للأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية إلى الأنبوب A والدوامة بلطف. ثم ، قم بالدوران لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لجمع كل السوائل في قاع الأنبوب.

بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من السائل من اثنين من A إلى أنبوب B.بعد الدوامة ، قم بتدويرها باستخدام جهاز طرد مركزي صغير الصغر. وبالمثل ، أضف محلولا من الأنبوب B إلى الأنبوب C ، ومن C إلى D ، وحتى الأنبوب H.أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف لكل بئر إلى ثلاثة آبار مثبتة بالمستضد وثلاثة آبار مسدودة باستخدام BSA فقط. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسماة A Standard إلى H Standard واحفظ هذه الأنابيب كمعايير للأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية ليتم فحصها في عداد غاما.

احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف. تسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيق لكل بئر كما هو موضح في المخطوطة. قم بشفط الجسم المضاد الموسوم إشعاعيا من آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا باستخدام شفاط فراغي.

الآن ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل بئر. استنشق المخزن المؤقت للغسيل وكرر الغسيل أربع مرات أخرى. قم بتقسيم الآبار إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المناسبة.

عد النشاط الإشعاعي في الأنابيب مع وضع علامة على المستضد على أنه H1 و H2 و H3 و H3 إلى A1 و A2 و A3 ، ثم مع وضع علامة BSA فقط على أنها H4 و H5 و H6 و A4 و A5 و A6 باستخدام عداد غاما. أظهر أميفانتاماب الموسوم إشعاعيا ارتباطا محددا لبروتينات EGFR و cMET. وبالمثل ، تم الاحتفاظ بالتقاربات الملزمة بواسطة fabs ذات الذراع الواحدة ذات العلامات المشعة المرتبطة ببروتينات EGFR و cMET.

أظهرت مخططات ربط التشبع أنه عندما تكون تركيزات الأجسام المضادة ذات العلامات المشعة منخفضة للغاية ، لم يتم تحقيق التشبع ، كما هو موضح في المنحنى الخطي. أدت تركيزات الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية التي كانت عالية جدا إلى التشبع دون نمو لوغاريتمي متميز ، كما هو موضح في الهضبة الأفقية. أيضا ، شوهد ارتباط غير محدد مرتفع بسبب تركيزات عالية من الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية.

قد يستغرق هذا الإجراء محاولات متعددة لتحسين نطاق التركيز لكل جسم مضاد محدد يحمل علامة إشعاعية. استخدم البيانات من النتائج السلبية للمساعدة في تصميم التجارب المستقبلية. بمجرد معرفة التقارب الملزم ، يمكن استخدامه كمعيار للفحوصات المخبرية الأخرى كجزء من توصيف الجسم المضاد الموسوم إشعاعيا.