استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة

يدعم PCLS تقييم نشاط خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء والأوعية الدموية في بيئة أنسجة سليمة تقريبا ، وبالتالي توفير نموذج لا يقدر بثمن خارج الجسم الحي للأبحاث الرئوية. من حيث أبحاث العضلات الملساء ، تحافظ شرائح الرئة المقطوعة بدقة على النمط الظاهري لخلايا العضلات الملساء في الجسم الحي وتفاعلها مع الهياكل المحيطة مع السماح بالوصول إلى خلايا العضلات الملساء ، وهو أمر مهم لدراسة ميكانيكية على المستوى الخلوي. للبدء ، ضع جسم الماوس على لوحة تشريح في وضع ضعيف.

قم بتثبيت الذيل والكفوف الأمامية والرأس باستخدام إبر حقنة 25G وقم بتعقيم الجسم بنسبة 70٪ من الإيثانول. افتح تجويف الصدر بعناية على طول القص والقفص الصدري السفلي الثنائي فوق الحجاب الحاجز. بعد ذلك، قم بتوجيه طرف المقص الحاد بعيدا عن أنسجة الرئة وقم بإزالة جزء من الأقفاص الصدرية البطنية الثنائية لفضح القلب.

لاحظ أن فصوص الرئة تنهار عندما يفتح تجويف الصدر. استخدم المقص لإزالة الأنسجة الرخوة في عنق الفأر لفضح القصبة الهوائية. في الطرف العلوي من القصبة الهوائية ، قم بعمل ثقب صغير قطره 1.2 ملم من شأنه أن يسمح بمرور طرف قسطرة وريدية على شكل حرف Y 20G.

قم بتوصيل منفذ محول واحد من القسطرة على شكل حرف Y بحقنة 3 ملليلتر معبأة مسبقا ب 0.5 ملليلتر من الهواء والمنفذ الآخر بحقنة 3 ملليلتر معبأة مسبقا بمحلول أغاروز 2 ملليلتر من محلول الأغاروز 1.5٪ الذي تم تسخينه إلى 42 درجة مئوية. حقن محلول الأغاروز لملء القسطرة ثم دفع القسطرة من خلال الفتحة إلى القصبة الهوائية إلى 5 إلى 8 ملم. حقن محلول الأغاروز ببطء بمعدل 1 ملليلتر لكل 5 ثوان.

لاحظ أن الرئة تتوسع على طول المحور القريب إلى البعيد. أوقف الحقن عندما يتم تضخيم حافة كل فص رئة. ثم ، حقن 0.2 إلى 0.3 ملليلتر من الهواء من المحقنة الأخرى لدفع الأغاروز المتبقي إلى الشعب الهوائية الموصلة إلى الفضاء الحويصلات الهوائية البعيدة.

أغلق كليب القصبة الهوائية بزوج من ملقط مرقئ منحني. لملء الأوعية الدموية الرئوية ، املأ حقنة 1 ملليلتر بالجيلاتين الدافئ بنسبة 6٪ وقم بتوصيلها بقسطرة وريد فروة الرأس بالإبرة. املأ القسطرة بمحلول الجيلاتين ثم ثقب البطين الأيمن بالقرب من الجدار السفلي بالإبرة.

ادفع الإبرة لمدة 2 إلى 3 ملليمترات في البطين الأيمن ووجه طرف الإبرة إلى الشريان الرئوي الرئيسي. حقن ما يقرب من 0.2 ملليلتر من محلول الجيلاتين ببطء في البطين الأيمن والأوعية الشريانية الرئوية. حافظ على الإبرة في مكانها لمدة خمس دقائق بعد الحقن وقم بتبريد فصوص الرئة عن طريق سكب محلول HBSS البارد على القلب والرئة ووضع الجسم في الثلاجة.

بعد هذه الخطوة ، قم بإزالة رئة الفأر والقلب من الأنسجة الضامة المحيطة بالمقص. ثم افصل كل فص رئوي واحتفظ به في محلول HBSS على الجليد. قم بتقليم فص الرئة وتوجيهه بحيث يكون اتجاه القطع عموديا على معظم الشعب الهوائية من الهلة إلى سطح الرئة.

قم بإرفاقه أعلى عمود العينة باستخدام الغراء الفائق. استخدم اهتزازا مع شفرة حلاقة رقيقة جديدة لقطع فص الرئة إلى شرائح 150 ميكرومتر. اجمع الشرائح في أطباق بتري معقمة معبأة مسبقا بمحلول HBSS البارد.

انقل الشرائح إلى أطباق بتري المليئة بوسط ثقافة DMEM / F-12. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل التجارب. ضع شريحة رئوية واحدة مقطوعة بدقة في كل بئر من لوحة زراعة 24 بئرا مملوءة ب HBSS.

حدد موقع الشريحة في منتصف البئر ثم قم بإزالة محلول HBSS باستخدام ماصة. تحت المجهر ، ابحث عن مجرى الهواء المستهدف والسفينة في الشريحة ثم قم بتغطيتها باستخدام شبكة نايلون مع ثقب مركزي مسبق القطع لفضح منطقة وعاء مجرى الهواء المستهدف. ضع غسالة معدنية مجوفة فوق الشبكة لتثبيت الشرائح في مكانها.

ثم أضف 600 ميكرولتر من محلول HBSS لغمر الشرائح. بعد 10 دقائق، سجل الصور الأساسية. للحث على مجرى الهواء أو تقلص الأوعية الدموية ، قم بإزالة محلول HBSS بحذر باستخدام ماصة وإضافة 600 ميكرولتر من HBSS باستخدام ناهض.

لإعداد المخزن المؤقت لتحميل صبغة الكالسيوم ، قم أولا بإذابة 50 ميكروغرام من الصبغة مع 10 ميكرولترات من DMSO و 0.2 جرام من مسحوق Pluronic F-12 في 1 ملليلتر من DMSO. امزج 10 ميكرولترات من محلول Pluronic مع 10 ميكرولترات من محلول صبغة الكالسيوم. أضف هذا الخليط إلى 2 ملليلتر من محلول HBSS الذي يحتوي على 200 ميكرومولار من السلفوبروموفثالين.

ثم ، ضع 15 شريحة رئوية مقطوعة بدقة في 2 ملليلتر من مخزن الكالسيوم المخزن المؤقت للتحميل واحتضنها عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، تليها الحضانة في HBSS التي تحتوي على 100 ميكرومولار سلفوبروموفثالين لمدة 30 دقيقة. ثم ، ضع شرائح محملة بصبغة الكالسيوم على كوب غطاء كبير. املأ شحوم السيليكون عالية الفراغ في حقنة سعة 3 ملليلتر متصلة بإبرة حادة 18G أو طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر وارسم خطين متوازيين عبر زجاج الغطاء ، أعلى وأسفل الشريحة.

غطي الشريحة باستخدام شبكة نايلون بين خطين من الشحوم. ضع زجاج الغطاء الثاني فوق الشبكة لإنشاء غرفة. أضف HBSS أو محلول ناهض إلى الغرفة من طرف واحد باستخدام ماصة.

قم بإزالة السائل من الغرفة عن طريق الشفط من الطرف الآخر باستخدام المناديل الورقية. غرفة الشريحة جاهزة الآن لتصوير الكالسيوم باستخدام مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر عالي السرعة. لوحظت حزم شريان مجرى الهواء الرئوي في شرائح رئوية مقطوعة بدقة بسماكة 150 ميكرومتر تحت مجهر تباين الطور.

في حالة الراحة ، تم تحديد مجرى الهواء بواسطة الخلايا الظهارية المكعبة مع الشريان الرئوي القريب. بعد التعرض للميثاكولين ، تم تقليل المنطقة المضيئة بينما لم يظهر الشريان الرئوي أي استجابة للمحفزات. تم تحديد استجابات انقباض مجرى الهواء كميا من خلال النسبة المئوية لانخفاض المساحة المضيئة وأظهرت استجابات مماثلة تعتمد على الجرعة في مزارع يوم واحد وخمسة أيام.

عند الوصول إلى حقل الرئة المحيطي ، تتفرع الشعب الهوائية الموصلة إلى القنوات التنفسية والأكياس المحيطة بالشرايين الصغيرة داخل الأسينار. عند التعرض للبطانة ، تنقبض كل من الشعب الهوائية والشرايين الرئوية ، والتي يتبعها الاسترخاء الناجم عن NOC-5. في حالة الراحة ، أظهرت الشرائح المحملة بصبغة الكالسيوم تألقا منخفضا في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء ونظام الأوعية الدموية تحت المجهر الفلوري البؤري.

عند التعرض للناهضات ، ارتفعت شدة تألق الكالسيوم في الخلايا وانتشرت إلى الخلية بأكملها ، والتي ارتبطت بالإشارات المتذبذبة. من الناحية التقنية ، من الضروري تضخيم الرئة باستخدام الأغاروز بشكل متجانس وتجنب حقن الأغاروز السريع أو المفرط. ادفع الهواء دائما في النهاية لطرد الأغاروز من مجرى الهواء الموصل إلى الفضاء الحويصلات الهوائية البعيدة.

باختصار ، باستخدام ثقافة شرائح الرئة المقطوعة بدقة ، يمكن للمرء أن يوفر مجموعة خاصة من وظائف العضلات الملساء الرئوية ونمذجة تحرير العضلات الملساء في المختبر. كما أنه يوفر منصة مثالية لفحص الأدوية الموسعة للأوعية الدموية أو الموسعة للشعب الهوائية.