تطوير نماذج ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر للتصوير والتحكم البصري الوراثي لوظيفة القلب
أغسطس 25, 2022
يصف هذا البروتوكول جيل ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر التي تعبر عن eNpHR2.0 أو ReaChR opsins في القلب لتصوير OCT وسرعة القلب البصرية الوراثية. تم الإبلاغ عن تعليمات مفصلة لتصوير ذبابة الفاكهة OCT وتعديل ضربات القلب ، بما في ذلك محاكاة السكتة القلبية القابلة للاستعادة ، وبطء القلب ، وعدم انتظام دقات القلب في الحيوانات الحية في مراحل النمو المختلفة.
يقدم البروتوكول نماذج ذبابة الفاكهة حيث يمكن تمييز وظيفة القلب والتحكم فيها باستخدام الضوء. وهذا يمكن الباحثين من دراسة أمراض القلب البشرية في ذبابة الفاكهة باستخدام الحيوانات السليمة. يمكن لهذه الطريقة أن تحقق بشكل موثوق تصوير OCT غير الغازي والتحكم البصري الوراثي في وظيفة القلب ذبابة الفاكهة.
لديها كفاءة وجودة عالية. يمكن أن تكون الوتيرة البصرية الجينية بديلا للوتيرة الكهربائية كعلاج لعلاج اضطرابات عدم انتظام ضربات القلب. يمكن توسيع نطاق التصوير OCT والوتيرة البصرية الجينية إلى أنظمة نموذجية أخرى مثل عضويات القلب وأسماك الحمار الوحشي والحلق الجنيني والقلب.
للبدء ، اجمع بين خمسة GAL4 يدوية على TM6 أنثى عذراء مزدوجة الأنابيب واثنين إلى ثلاثة ذباب ذكور من UAS Ops و Stocks لكل قارورة. في اليوم التالي ، قم بإعداد طعام شبه محدد وفقا لتعليمات مركز بلومنجتون لذبابة الفاكهة عن طريق إضافة 5.14 جرام لكل 100 ملليلتر من السكروز إلى وعاء على طبق ساخن. ثم قم بتبريده إلى 60 درجة مئوية مع التحريك المستمر.
بعد ذلك ، قم بإعداد قوارير ذبابة ضيقة عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول الإيثانول الشبكي الشبكية بالكامل إلى 100 ملليمول إلى كل قارورة. استخدم ماصة مصلية للتخلص من خمسة ملليلترات من طعام الذبابة لكل ذبابة ضيقة. بعد الدوامة بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان ، قم بتوصيل هذه القوارير ولفها في القماش الداكن لحمايتها من الضوء.
في اليوم التالي ، انقل الذباب الذي يضع البيض بثبات إلى القوارير مع الإيثانول الشبكي الذي يحتوي على طعام. حماية الرفوف مع قوارير من الضوء. بعد 24 إلى 48 ساعة ، اعتمادا على عدد البيض الموضوعة ، تخلص من الوالدين لمنع الاكتظاظ السكاني في القارورة.
بعد ذلك ، جمع ذرية غير أنبوبي لتصوير القلب. اختر خيار UAS اليد GAL4 يرقة أو خادرة من القارورة ، وضعها على منديل ، وامسح الوسائط بلطف من سطح الجسم باستخدام فرشاة الطلاء. تحضير شريحة المجهر مع قطعة صغيرة من الشريط على الوجهين في الوسط.
بعد ذلك ، ضع اليرقة أو الخادرة برفق على سطح الشريط مع الجانب الظهري لأعلى وعموديا على الجانب الطويل من الشريحة باستخدام فرشاة أو ملاقط دقيقة. ضع ضغطا لطيفا لتوصيل اليرقة أو الخادرة بسطح الشريط. الآن ، قم بإعداد الشريحة على مرحلة التصوير مع توجيه اليرقة أو الخادرة لأسفل وتشغيل التصوير المقطعي للتماسك البصري أو مصدر ضوء OCT بواسطة برنامج التحكم بالليزر.
افتح برنامج التحكم OCT المخصص للمجال الطيفي المكتوب. ثم انقر فوق نافذة المعاينة. ثم قم بتعيين معلمات المسح الضوئي في برنامج OCT للمجال الطيفي.
استخدم المتلاعبين الدقيقين للتحكم في مرحلة العينة لجلب قلب الذبابة إلى بؤرة التركيز. اضبط الوضع البؤري لتقليل انعكاس الضوء من سطح بشرة الذبابة. أيضا ، فكر في تطبيق الزيت المعدني على سطح اليرقة أو الخادرة لتقليل الانعكاس.
بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات المسح الضوئي للحصول على صورة OCT في الوضع M والحصول على خمس مجموعات من بيانات التحكم بدون نبضات تحفيز الضوء الأحمر لحساب معدل ضربات القلب أثناء الراحة. صمم نبضة الضوء لتحفيز السرعة في برنامج التحكم OCT المخصص. لهذا ، انقر فوق علامات تبويب الإعدادات وأضف تسلسلات نبضات الضوء المصممة للتحكم في تردد النبض وعرض النبضة ومدة التحفيز ووقت الانتظار وفقا لبروتوكولات التحفيز المختلفة.
ثم افتح برنامج التحكم في الضوء لتوليد نبضات الضوء الأحمر. اختر وضع النبض في تحديد الوضع. انقر نقرا مزدوجا فوق الشكل الخاص بإعدادات ملف تعريف النبض، واختر وضع المتابع.
حافظ على شدة التوقف عند الصفر واضبط النسبة المئوية للكثافة عند حساب كثافة الطاقة الفعلية. احصل على مقاطع فيديو في وضع M لقلب ذبابة الفاكهة النابض مع التحفيز الخفيف بالنقر فوق اكتساب في برنامج OCT Control. سجل ومضات من الضوء الأحمر أسفل قلب الذبابة أثناء الحصول على التصوير.
لاحظ أن إعدادات السرعة المختلفة مطلوبة للتحكم في وظيفة قلب الذبابة باستخدام طرز ذبابة channelrhodopsin و NPHR ذات الانزياح الأحمر. افتح برنامج تجزئة قلب الذبابة المطور المخصص وانقر على ملف محدد. ثم حدد الملف المراد تحليله في واجهة المستخدم الرسومية.
أدخل كلا من الحدود الرأسية والأفقية لمنطقة القلب بالبكسل في مربعات النص العلوية. انقر على تغيير الحجم. باستخدام شريط التمرير الموجود في الأسفل ، تأكد من أن منطقة القلب بأكملها مرئية وأنها تملأ الصندوق بأكمله للمجموعة بأكملها.
بعد النقر فوق علامة التبويب "توقع" ، سيمر البرنامج عبر كل شريحة في المجموعة ويحدد منطقة القلب في حوالي ثلاث دقائق. بمجرد اكتمال التنبؤ ، انقر فوق مخطط الموارد البشرية لعرض مخطط لمنطقة القلب بمرور الوقت في نافذة جديدة. حدد مناطق الذروة أو الوادي الصحيحة ، واختر النبض ثم علامات تبويب الموارد البشرية لإنشاء شكل نهائي.
سيتم حفظ المعلمات الوظيفية في وقت واحد في ملفات CSV. تم التحقق من خصوصية الأنسجة لسائق GAL4 اليدوي عن طريق تصوير تعبير البروتين الفلوري الأخضر. يتم عرض صور OCT النموذجية للمقطع العرضي لليرقات والعذراء هنا.
لتقليد أمراض القلب المختلفة ، تم تصميم أربعة أنواع من نبضات الضوء. نبضة واحدة تستمر 10 ثوان بعد خمس ثوان من وقت الانتظار ، ولدت سكتة قلبية قابلة للترميم. بالنسبة لسرعة القلب عند ترددات أقل من معدل ضربات القلب أثناء الراحة ، تم استخدام تسلسلين لنبضات الضوء بترددات سرعة تساوي نصف معدل ضربات القلب أثناء الراحة ، وربع معدل ضربات القلب أثناء الراحة لمدة ثماني ثوان مع وقت انتظار مدته ست ثوان بينهما.
يتكون نمط التحفيز لزيادة معدل ضربات القلب بسبب تنشيط قناة رودوبسين ذات الانزياح الأحمر من ثلاث تسلسلات من نبضات الضوء. أدى انخفاض وتيرة تقلص القلب بعد الإشارات الضوئية إلى تباطؤ معدل ضربات القلب الذي يحاكي اليرقة والخادرة. تم تطبيق سلسلة من ثلاثة قطارات نبضات ضوئية بترددات تحفيز مختلفة على اليرقات وأظهرت قلوب الشرانق بوضوح زيادة معدل ضربات القلب بعد نبضات الضوء.
يعد اختيار إعداد النسل الصحيح ، وتركيب العينة ، وإجراء التصوير أمرا ضروريا. نأمل في نقل تكنولوجيا الوتيرة البصرية الجينية إلى نماذج حيوانية أكبر ، لدراسة أمراض قلب الثدييات واستكشاف طرق علاجية جديدة لعلاج عدم انتظام ضربات القلب.
المراجعة
يوضح هذا البروتوكول توليد Drosophila melanogaster التي تعبر عن الاوبسينات لتصوير التصوير المقطعي الترابطي البصري (OCT) وتنظيم ضربات القلب الضوئي الجيني. يوفر طرقًا مفصلة لتعديل وظيفة القلب في الحيوانات الحية، بما في ذلك محاكاة حالات القلب المختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- التنظيم الضوئي الجيني
- البحث القلبي الوعائي
الخلفية
- تسمح نماذج Drosophila بدراسة وظيفة القلب والمرض.
- تُمكّن تقنيات التنظيم الضوئي الجيني التحكم الدقيق في نشاط القلب.
- يوفر تصوير OCT تصورًا غير باضع لديناميكيات القلب.
- يمكن توسيع هذا النهج ليشمل أنظمة نموذجية أخرى.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لتصوير وظيفة القلب ومراقبتها بطريقة غير باضع في Drosophila.
- محاكاة حالات القلب مثل تباطؤ القلب وزيادة معدل ضربات القلب.
- استكشاف التنظيم الضوئي الجيني كعلاج محتمل لاضطرابات نظم القلب.
الطرق المستخدمة
- توليد Drosophila التي تعبر عن الاوبسينات.
- تحضير طعام يحتوي على retinal all-trans لليرقات.
- التصوير المقطعي الترابطي البصري (OCT) لتصوير وظيفة القلب.
- تصميم تسلسلات النبضات الضوئية للتنظيم الضوئي الجيني.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح لوظيفة قلب Drosophila باستخدام OCT.
- تدليل التحكم الضوئي الجيني على معدل ضربات القلب.
- القدرة على محاكاة حالات القلب المختلفة من خلال التحفيز الضوئي.
- إمكانية التطبيق في نماذج حيوانية أكبر.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة نهجًا موثوقًا لدراسة وظيفة القلب في Drosophila.
- قد يعمل التنظيم الضوئي الجيني كبديل لطرق التنظيم التقليدية.
- قد توسع الدراسات المستقبلية هذه التقنية إلى نماذج حيوانية ثديية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Non-invasive optogenetic control and imaging of cardiac function in Drosophila melanogaster enables high-throughput, genetically tractable modeling of cardiac phenotypes relevant to human disease. This platform supports early-stage mechanistic de-risking and target validation for cardiac drug discovery by providing quantitative, reproducible readouts in a whole-organism context. Integration of OCT imaging with optogenetic pacing advances predictive confidence and translational continuity from discovery biology to preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cardiac function and arrhythmia mechanisms in a genetically defined, in vivo system.
- Supports functional target validation by linking genetic perturbations to quantitative cardiac phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through precise, reversible modulation of heart activity.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, scalable platform for quantitative assessment of cardiac responses to genetic or pharmacological interventions.
- Delivers reproducible, high-content imaging and optogenetic stimulation outputs for assay standardization.
- Enables screening readiness for compounds affecting cardiac rhythm or contractility in a whole-organism context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease-relevant cardiac phenotypes in Drosophila with translational biomarker strategies.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by modeling arrhythmia and bradycardia in vivo.
- Provides predictive de-risking for cardiac safety and efficacy prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven cardiac studies, quantitative phenotyping, and assay development in a genetically tractable model. It is positioned for integration from target validation through lead identification and preclinical risk assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for cardiac targets using optogenetic and imaging readouts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screening in a whole-organism system.
- Analytics: Provides high-resolution, time-resolved measurements of heart function for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of Drosophila cardiac phenotypes with preclinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for cardiac research across multiple genetic backgrounds and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Standardizes non-invasive, high-throughput cardiac phenotyping and optogenetic control workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early risk assessment of cardiac liabilities.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs with quantitative, translational data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, optogenetics, and OCT imaging.
- Needs access to custom imaging and light stimulation instrumentation with integrated analysis software.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptation to other model systems (e.g., organoids, zebrafish) may require protocol optimization.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise genetic control.
