ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر روس لصيف 2021 ، وخاصة K. Alice Lindsay ، على مساعدتهم. تم دعم هذا العمل من خلال منحة من NSF BIO-2134215 التي دعمت S. Sahu و N. Goodbee و H.B. Lee و J.L. Ross. منحة من مؤسسة KECK (راي أندرسون ، دولار أمريكي ، PI الرئيسي) دعمت جزئيا R. Branch و P. Chauhan

<ol><li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins%3A+structuring+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).</li>
<li>Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+meiotic+spindle+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte meiotic spindle assembly and function.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).</li>
<li>Brugués, J., Needleman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+spindle+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical basis of spindle self-organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).</li>
<li>Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+transport+organize+microtubules+in+metaphase+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles.</a> Cell. 149 (3), 554-564 (2012).</li>
<li>Gatlin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+fusion+requires+dynein-mediated+sliding+of+oppositely+oriented+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules.</a> Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).</li>
<li>Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmin%3A+A+protein+complex+required+for+centrosome-independent+microtubule+generation+within+the+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle.</a> Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+by+labile+association+of+the+nature+of+mitotic+spindle+fibers+and+their+role+in+chromosome+movement+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules.</a> Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).</li>
<li>Allenspach, A. L., Roth, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variations+during+mitosis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variations during mitosis in the chick embryo.</a> Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).</li>
<li>Theg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+microtubules+in+different+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic microtubules in different animal cells.</a> Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).</li>
<li>Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+anaphase+spindle+elongation+in+Diatoma+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare.</a> Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).</li>
<li>Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChaikin%2C+PM+%22Principles+of+Condensed+Matter+Physics%22">Principles of Condensed Matter Physics</a>. , Cambridge University Press. (1995).</li>
<li>Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+and+collective+behavior+of+microtubule+bundles+in+the+presence+of+polyamines%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines.</a> Biophysical Journal. 101 (1), 205(2011).</li>
<li>Needleman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+assembly+of+microtubules+by+counterions%3A+From+hexagonal+bundles+to+living+necklaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).</li>
<li>Ross, J. L., Fygenson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+taxol+in+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility of taxol in microtubule bundles.</a> Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).</li>
<li>Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-like+beating+of+active+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cilia-like beating of active microtubule bundles.</a> Science. 333 (6041), 456-459 (2011).</li>
<li>Brandt, R., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+microtubule-associated+protein+tau.+Identification+of+regions+which+affect+microtubule+growth%2C+nucleation%2C+and+bundle+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173(1989).</li>
<li>MacRae, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+by+cross-linking+and+bundling+proteins.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Structure+and+Molecular+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).</li>
<li>She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+Ase1%2FPRC1%2FMAP65+family+in+central+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly.</a> Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).</li>
<li>Walczak, C. E., Shaw, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAP+for+Bundling+Microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAP for Bundling Microtubules.</a> Cell. 142 (3), 364-367 (2010).</li>
<li>Edozie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+spindle-like+microtubule+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Self-organization of spindle-like microtubule structures.</a> Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).</li>
<li>Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+the+microtubule+cross-linking+protein+MAP65-1+reveals+a+molecular+mechanism+for+contact-angle-dependent+microtubule+bundling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling.</a> Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).</li>
<li>Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li>
<li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li>
<li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li>
<li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li>
<li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408(2021).</li>
<li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+MAPs%2C+and+motor+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li>
<li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022).</li>
<li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903(2021).</li>
<li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+and+testing+of+a+new%2C+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme%2C+katanin+p60%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li>
<li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li>
<li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li>
<li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li>
<li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+katanin%2C+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li>
</ol>

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.

تم استخدام الطرق الموضحة هنا في العديد من الأوراق لإنشاء تاكتويدات الأنابيب الدقيقة (الشكل 2) 22,28. هذه التجارب ذات صلة بيولوجية للمساعدة في الكشف عن المبادئ التنظيمية التي تتحكم في شكل واستقرار المغزل الانقسامي أو الوسيط في معظم أنواع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأنابيب الدقيقة هي نموذج للميسوجينات البلورية السائلة التي يمكن أن تساعد في معرفة المزيد حول كيفية نواة البلورات السائلة ونمو المراحل الخيطية من المراحل متساوي الخواص.
الإجراء الموضح هنا له العديد من المزايا لاستكشاف التنظيم الذاتي للأنابيب الدقيقة. أولا ، إنه قابل للتكرار بشكل كبير ، حيث تم إجراؤه في المختبر من قبل العديد من الطلاب ، بما في ذلك طلاب المدارس الثانوية ، مع القليل من المعرفة المسبقة أو التدريب قبل البدء في المختبر. اللباقات ثنائية الانعكاس22 ، مما يسمح برؤيتها في الضوء المنقول بالإضافة إلى الفحص المجهري الفلوري ، مما يجعل هذه الطريقة في متناول العديد من المختبرات وهذا الإجراء التجريبي قابل للتكيف مع الأغراض التعليمية ، بالإضافة إلى الأبحاث الراقية. وأخيرا، تفتح هذه العملية آفاقا لمواصلة فهم الأنظمة البيولوجية والتحقيق فيها في نهج مختزل وتجريدي، مما يسمح للمرء بفهم كيف يمكن لكل حالة إضافية أو بروتين أو مادة مضافة أن تغير التنظيم الذاتي لللباقات، وربما في نهاية المطاف، المغزل. تشمل أهداف المحاكاة الحيوية الأفضل النشاط والسيولة وفرز قطبية الخيوط.
يمكن أن يكون هناك العديد من العوامل التي تؤثر على التجربة مما يعطي نتائج غير متوقعة. على سبيل المثال ، إذا لم تتشكل اللباقات (الشكل 2) ولكن لوحظت أنماط تشبه المروحة ، فمن المحتمل ألا يكون MAP65 موجودا أو غير ملزم بالأنابيب الدقيقة22,28. يجب أن يكون هذا واضحا في قناة التألق MAP65 أيضا لأن GFP-MAP65 لن يكون مرتبطا بالأنابيب الدقيقة.
إذا لم تتشكل اللباقات وظهرت الخلفية كبقع على الزجاج ، فقد يكون هذا بسبب طلاء السطح. بمجرد القيام به ، يستمر silanization فقط 1 شهر على coverslips. عندما يزول ، سيكون التوبولين قادرا على الارتباط بالسطح المكشوف بشكل غير محدد. سيحدث هذا الربط في أنماط غريبة.
إذا لم تتشكل اللباقات ولوحظ التوبولين في مجاميع من مختلف الأشكال والأحجام ، فقد يكون هذا بسبب التوبولين ذي الجودة الرديئة. يمكن طرد التوبولين مركزيا لإزالة المجاميع الأولية التي يمكن أن تدفع هذا التجميع خارج المسار بدلا من بلمرة الأنابيب الدقيقة. إذا كان السطح مرتبطا بالتوبولين ، فيمكنه أيضا استنفاد التوبولين في المحلول. يمكن أن تؤدي التركيزات المنخفضة من التوبولين ، أقل من التركيز الحرج لبلمرة الأنابيب الدقيقة ، إلى مجاميع.
في تجارب FRAP ، إذا لم تظهر قناة MAP65 أي استرداد (الشكل 5) ، فمن المحتمل أن يكون التبييض الضوئي قد ألحق الضرر الضوئي بالأنابيب الدقيقة. يتسبب الضرر الضوئي في التدمير الموضعي للخيوط. يمكن التحقق من ذلك عن طريق الفحص في القناة المرسلة. يمكن رؤية اللباقات ذات الأنابيب الدقيقة في القناة المنقولة من خلال مؤشر مرتفع لعدم تطابق الانكسار مع الماء المحيط. سيظهر الضرر الضوئي الناجم عن الضوء كعلامة حرق أو فقدان التباين في التصوير الضوئي المنقول في موقع عائد الاستثمار الخاضع للتبييض الضوئي. إذا حدث هذا ، يجب تقليل طاقة الليزر أو الضوء لمنع التلف الضوئي للبروتينات.
وكانت هناك العديد من التحديات التي تمت مواجهتها في هذا الإجراء والنهج. إحدى المشكلات هي أن قياسات الطول يتم تنفيذها حاليا يدويا بالنقر فوق الصورة. هذه الطريقة ، على الرغم من أنها واضحة ، يمكن أن تؤدي إلى درجة عالية من عدم اليقين. يعد قياس العرض الذي يستخدم المقطع العرضي والملائم للغاوسي طريقة أفضل لقياس الحجم. ويمكن استخدام طريقة مماثلة للطول. القضية الثانية هي أنه في بعض الأحيان ، يمكن أن تنحني اللباقة ، لأنها طويلة ورقيقة جدا. هذا يجعل تحديد الطول أكثر صعوبة. يمكن تحديد طول الكفاف كميا باستخدام خط مجزأ ، ولكن هناك عدم يقين إضافي في كل مرة تتم فيها إضافة مقطع.
من منظور علمي ، يواجه هذا النهج بعض التحديات الأخرى لاستخدامه كنموذج للبلورات السائلة أو المغزل. كان التحدي الأول هو الشكل الطويل والرقيق للكتل التي تخلقها الأنابيب الدقيقة (الشكل 3 والشكل 4). وكما لوحظ في المنشورات السابقة22 ، فإن تاكتويد الأنابيب الدقيقة هي تاكتويد متجانسة ، وليست ثنائية القطب. هذا يعني أن الأنابيب الدقيقة التي تشكل الشكل لا تعيد التوجيه للإشارة إلى أطراف الهيكل. بدلا من ذلك ، تكون جميع الأنابيب الدقيقة موازية للمحور الطويل وتقع "القطبين" في ما لا نهاية. هذا يختلف اختلافا كبيرا عن tactoids التي لوحظت للبلورات السائلة الجزيئية أو حتى للأكتين أو الحمض النووي التي يمكن أن تعمل أيضا كميسوجينات بلورية سائلة. في هذه الأنظمة الأخرى ، تكون اللباقة ثنائية القطب ، وعندما ينظر إليها في المستقطبات المتقاطعة ، فإنها تظهر علامات منبهة لإعادة توجيه القضبان.
التحدي الرئيسي الثاني في هذا النظام هو أن الأنابيب الدقيقة غير متحركة داخل اللباقة. هذا واضح من تجارب وتحليل FRAP لأن استعادة الأنابيب الدقيقة منخفضة للغاية. طبيعتها الشبيهة بالصلبة تجعل تاكتويدات الأنابيب الدقيقة أقل قيمة مثل نظائرها البلورية السائلة واسعة النطاق. يجب أن يكون للمرحلة الخيطية للبلورة السائلة خصائص سائلة (سائلة) وبلورية (منظمة). على الرغم من أن الشكل يبدو مناسبا للمغزل ، إلا أن الجمود يجعل النظام أقل إثارة كمغزل ميتوتيكي نموذجي. من ناحية أخرى ، توفر هذه المشكلة فرصا للتحقيق في كيفية تعديل التجارب لخلق المزيد من السيولة في النظام.
توفر هذه التحديات العلمية فرصا مثيرة من شأنها أن تسمح بمعرفة جديدة حول النظام. لجعل tactoids microtubule أكثر ثنائية القطب ، يمكن للمرء استخدام microtubules أقصر. ومع ذلك ، هناك تحد إضافي ، لأن الأنابيب الدقيقة لا تحتوي على العديد من بروتينات السد المميزة جيدا للتحكم في الطول كما يفعل الأكتين. يتطلب استخدام النوى والنمو استخدام تركيزات عالية جدا من التوبولين و GMPCPP لصنع أنابيب دقيقة قصيرة. ينتج عن تركيز التوبولين العالي عدد أكبر من الخيوط في النظام ، مما يجعل من الصعب فصل اللباقة عن بعضها البعض. قد تساعد إضافة أغطية الأنابيب الدقيقة الجديدة ، مثل DARPin33 ، في هذا الموقف. يمكن التخفيف من المشكلة الثانية المتمثلة في أن الأنابيب الدقيقة غير متحركة عن طريق إضافة البروتينات الحركية ، مثل kinesin-534 ، والتي هي رباعيات المحركات المستخدمة في الانقسام الخيطي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام dimers الاصطناعية من dimeric kinesin-115.
هناك طريقة أخرى لإضافة المزيد من السيولة تتمثل في السماح للأنابيب الدقيقة بأداء عدم استقرارها الديناميكي ، ونمو وتقلص الأنابيب الدقيقة. حاليا ، الأنابيب الدقيقة التي يتم زرعها بخيوط GMPCPP مستقرة ثم تخضع لعدم الاستقرار الديناميكي أطول بكثير من المطلوب لتشكيل مغزل أو لباقة ، مما قد يؤدي إلى منظمات طويلة جدا مثل المراوح أو الحزم. لذلك ، يجب إضافة عدم الاستقرار الديناميكي للأنابيب الدقيقة بعناية للحفاظ على شكل التاكتويد. إضافة البروتينات والإنزيمات المرتبطة التي يمكن أن تتحكم في الطول قد تخفف من هذه المشكلة. على سبيل المثال ، من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى إزالة البلمرة من الكينيسين ، مثل كينيسين-13 35 ، أو قطع الإنزيمات ، مثل الكاتانين36. هذه التجارب معقدة وصعبة ، على الرغم من أنها ستكون ثاقبة للغاية بغض النظر عما تكشفه النتائج. أيا كان الاتجاه الذي تتخذه التجارب المستقبلية ، فإن المنصة التي تم تطويرها هنا لإنشاء tactoids microtubule يمكن أن تكشف عن معلومات جديدة على الأساس المادي لتنظيم microtubule.

انقسام الخلايا عن طريق الانقسام هو واحد من أهم العمليات البيولوجية للحفاظ على الحياة. خيوط الأنابيب الدقيقة ، التي تتكون من ديمرات توبولين ، هي عناصر هيكلية أساسية لهذه العملية. تسمى الآلية العابرة التي تم إنشاؤها في مرحلة ما قبل الطور عندما تكون الكروموسومات محاذاة في مركز الخلية المغزل الانقسامي بسبب شكله ، والذي يشبه مغزل نول مغطى بخيوط (الشكل 1A). من الثابت عبر العديد من الكائنات الحية أن الأنابيب الدقيقة تستخدم في الطور الفوقي لدفع وسحب الكروموسومات المكثفة إلى وسط الخلية ، ومحاذاتها وربطها بالأنابيب الدقيقة التي ستسحبها بعيدا في الطور (الشكل 1B ، C). يتشكل المغزل في كل من الانقسام الاختزالي (الشكل 1B) والانقسام (الشكل 1C) ، الذي تم إنشاؤه من العديد من الأنابيب الدقيقة المتداخلة غير الملفوفة حول المحور المركزي مثل الخيط ولكنها تعمل بالتوازي مع الواجهة. يتطلب إنشاء هذه الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة بروتينات مرتبطة ترتبط بالإنزيمات المرتبطة بها والإنزيمات المرتبطة بها والتي يمكن أن تعمل كمحركات للمساعدة في دفع وسحب الكروموسومات1.
أظهرت الدراسات التي أجريت على المغزل الوسيط أن الأنابيب الدقيقة قصيرة وديناميكية ومتداخلة في المصفوفات المتقاطعة2،3،4،5،6 (الشكل 1Di). نظرا للتنظيم الفيزيائي لهذه الأنابيب الدقيقة القصيرة ، فإن المغزل meiotic يشبه تاكتويد الكريستال السائل (الشكل 1E). في الواقع ، ثبت أن المغزل يتجمع ويندمج ، كما يتوقع المرء من اللباقة البلورية السائلة5.
استخدمت العديد من الدراسات التي يعود تاريخها إلى 1960s التثبيت ، والمقاطع التسلسلية ، والمجهر الإلكتروني لتحديد أن هناك نوعين من الأنابيب الدقيقة داخل المغزل الانقسامي7،8،9،10. النوع الأول يسمى الأنابيب الدقيقة kinetochore ، والتي تربط قطب المغزل ب kinetochore. النوع الثاني يسمى الأنابيب الدقيقة بين الأقطاب أو القطبية ، والتي تنمو بعد الكروموسومات وتتداخل في المنطقة الوسطى (الشكل 1Dii)8,9,10. وهناك نوع ثالث يسمى الأنابيب الدقيقة النجمية ، والتي تقع خارج المغزل وتربط القطبين بحافة الخلية. منظمات الأنابيب الدقيقة هذه خارج نطاق المناقشة الحالية. كانت هناك دراسات حديثة حول التفاعل بين الأوجمين6 ومجمع حلقة غاما توبولين الذي يؤثر على مراكز التنوي للأنابيب الدقيقة ، مما أدى إلى مغزل انقسامي مع أنابيب دقيقة أقصر كما هو الحال في الشكل 1D.
نظرا لأن الأنابيب الدقيقة أطول من عرضها ، مع نسبة عرض إلى ارتفاع عالية وصلابة عالية ، فهي تشبه الإصدارات الموسعة من جزيئات الكريستال السائل. في فيزياء المادة اللينة، تم تقريب الذرات والجزيئات باستخدام الحد الأدنى من التفاعلات لاستنتاج الآليات الفيزيائية لانتقالات الطور، بما في ذلك النوى وذوبان البلورات11. وبالمثل ، فإن الأنابيب الدقيقة هي أجسام متوسطة الحجم هي نسخ موسعة من جزيئات البلورات السائلة ، مما يعطي نظرة ثاقبة لفيزياء ديناميكيات البلورات السائلة ، بما في ذلك نواة ونمو المراحل الخيطية من تلك المتساوية الخواص. علاوة على ذلك ، كما نوقش أعلاه ، يعرض المغزل meiotic خصائص مثل خصائص tactoid البلورية السائلة ، وهي حالة نيماتية تنوي وتنمو من الحالة المتساوية لجزيئات الكريستال السائل 3,4,5. بالنسبة لل tactoids ، فإن النوى والنمو يشبهان نمو البلورات الأخرى (أي تتطلب تركيزا عاليا نسبيا من الميزوجينات [الجزيئات التي تشكل بلورات سائلة]). يأتي شكل "المغزل" الفريد من نوعه للتاكتويد من المحاذاة المحلية للميزوجينات البلورية السائلة التي تتماشى مع الطور الخيطي (الشكل 1E). لا يمكنهم تشكيل بلورة مستديرة لأن الجزيئات غير متماثلة للغاية. بالنظر إلى طبيعة الأنابيب الدقيقة ، ربما ليس من المستغرب أن تكون آلات المغزل الانقسامية المصنوعة من تركيز محلي عال من الأنابيب الدقيقة هي أيضا من نفس الشكل ، سواء كانت تسمى tactoid أو المغزل. يمكن أن تكون اللباقات ثنائية القطب ، مع أقطاب في النهايات المدببة (الشكل 1Ei) ، أو متجانسة ، مع أقطاب فعالة في اللانهاية (الشكل 1Eii).
نظرا لأهمية تكوين المغزل ، كانت الجهود جارية نحو تكوين المغزل المنظم ذاتيا في المختبر من خلال إظهار تكثيف الأنابيب الدقيقة في حزم عبر الأنواع الأيونية 12,13 ، وعوامل الازدحام التي تخلق تفاعلات النضوب 14,15 ، وبروتينات محددة متقاطعة للأنابيب الدقيقة13,16,17,18,19 ، 21. من المثير للدهشة أنه على الرغم من أن هذه العوامل تعمل جميعها على زيادة التركيز المحلي للأنابيب الدقيقة ، إلا أنها غالبا ما تؤدي إلى حزم طويلة من الأنابيب الدقيقة ولكن ليس اللباقات. قد يكون أحد الأسباب التي تجعل هذه الحزم طويلة هو أن الأنابيب الدقيقة التي تتكون منها طويلة أيضا. كما أفادت الأعمال الأخيرة التي استخدمت الأنابيب الدقيقة الأقصر عن حزم أطول غير مدببة في نهاية15؛ في هذه الحالة ، يتم الاحتفاظ بالحزم مع البروتينات الحركية التي تسبب امتداد الحزم ، وبالتالي تجعلها أطول. هناك حاجة إلى أنابيب دقيقة قصيرة مع وصلات متقاطعة غير قابلة للتمدد للتجميعات المدببة التي تشبه المغزل ، كما هو موضح هنا.
في الآونة الأخيرة ، قمنا بتطوير تقنية لتمكين إنشاء tactoids microtubule باستخدام crosslinker المضادة للتوازي ، MAP65 ، في وجود microtubules22 المستقرة النووية. يجب أن تكون الأنابيب الدقيقة قصيرة ، ولكن القليل من المنظمين المعروفين لطول الأنابيب الدقيقة يمكنهم الحد من الأنابيب الدقيقة ضد عدم الاستقرار الديناميكي أو التلدين من طرف إلى طرف. بدلا من ذلك ، تم استخدام GMPCPP لنواة واستقرار الخيوط بعد النمو. سمح هذا بإنشاء كثافة عالية من الأنابيب الدقيقة القصيرة التي يمكن أن تنظم نفسها في اللباقة. كانت هذه اللباقات متجانسة عند النظر إليها تحت الانكسار المزدوج. بالإضافة إلى الأنابيب الدقيقة القصيرة ، تم استخدام رابط متقاطع محدد مضاد للتوازي ، MAP65 ، لتشكيل tactoids (الشكل 2). MAP65 هو بروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة النباتية في عائلة PRC1 / Ase1 من الروابط المتقاطعة الانقسامية23. يوجد MAP65 كخافت ، مع تقارب قوي للارتباط بنفسه وكذلك الأنابيب الدقيقة24. على عكس المغزل الوسيط و tactoids التي لوحظت مع خيوط الأكتين25،26،27 ، والتي هي ثنائية القطب ولها خصائص تشبه السائل من البلورات السائلة ، وقد لوحظ أن tactoids microtubule تشبه الصلبة22,28.
هنا ، يتم تقديم بروتوكولات لإنشاء tactoids microtubule وتوصيف شكل التجمعات وحركة المكونات باستخدام التقنيات القائمة على التألق.

<table><tbody><tr><td>2٪ ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان</td><td>GE للرعاية</td><td>الصحية 118945</td><td>معالجة سطحية سيلان كارهة للماء. يمكن إعادة استخدامه حتى ثلاث مرات وحفظه في درجة حرارة الغرفة لمدة عام واحد.</td></tr>5 <tr><td>دقائق إيبوكسي</td><td>بوب سميث صناعات</td><td></td><td>لختم الغرف التجريبية</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>32900HPLC</td><td>100٪</td></tr> <tr><td>BL21 خلايا</td><td>Bio</td><td>Labs C2527I</td><td>الخلايا البكتيرية المختصة المستخدمة للتعبير عن MAP65</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>جزء من نظام كسح الأكسجين. يتم تصنيع مخزون 300 مجم / مل في ddH2O وتخزينه في 10 مو ؛ ل aliquots في -20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى عام واحد.</td></tr><tr><td>أغطية (22 مم × 22 مم أو 22 مم × 30 مم)</td><td>فيشر</td><td>12544-AP</td><td>للغرف التجريبية</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>جزيء صغير يستخدم لكسر روابط ثاني كبريتيد ومسح الأكسجين. مخزون 1 متر مصنوع من مسحوق (سيجما) في ddH2O. يتم نقل المحلول وتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد. يتم استخدام الحصص 7-8 مرات ثم يتم التخلص منها.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>المكون الأساسي للعازلة Tubulin</td></tr><tr><td>أنابيب Eppendorf 0.5 مل</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>لعقد الحلول التجريبية</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>111000200</td><td>200</td></tr><tr><td>دليل ورق ترشيح</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>للتنظيف وسحب المحاليل من خلال الغرف التجريبية</td></tr><tr><td>مجهر مضان مع NA مرتفع الأهداف</td><td>نيكون</td><td>Ti-E, W2 متحدي البؤر</td><td>لتجارب التصوير</td></tr><tr><td>الفريزر -20&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>لتخزين الكواشف</td></tr><tr><td>الفريزر -80 درجة ؛ C</td><td>Thermo Scientific</td><td>328223H01-C</td><td>لتخزين البروتينات.</td></tr><tr><td>حاويات زجاجية للسيلان</td><td>مايكلز</td><td></td><td>لإعداد الغرف التجريبية - معالجة زجاج الغطاء</td></tr><tr><td>الشرائح الزجاجية</td><td>فيشر</td><td>12544-4</td><td>للغرف التجريبية</td></tr><tr><td>الجلوكوز</td><td>سيجما</td><td>G7528-250G</td><td>جزء من نظام كسح الأكسجين. يتم تصنيع مخزون 300 مجم / مل في ddH2O وتخزينه في 10 مو ؛ ل aliquots في -20 درجة مئوية.</td></tr><tr><td>الجلوكوز أوكسيديز</td><td>سيجما</td><td>G2133-250KU</td><td>جزء من نظام كسح الأكسجين. يتم تخزين هذا في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى عام واحد.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>نظير قابل للتحلل المائي ببطء من GTP يستخدم لبلمرة الأنابيب الدقيقة وتثبيتها عن طريق تقليل عدم الاستقرار الديناميكي والتركيز الحرج التلقائي لتنوي الأنابيب الدقيقة للحصول على طول ثابت. نشتري مخزونا بقيمة 10 ملي متر من Jena Biosciences ونخزنه عند -20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى عام واحد.</td></tr><tr><td>عنصر تسخين للمجهر</td><td>حاضنة Okolab العلوية</td><td>لتجارب التصوير Imidizole</td>Sigma I2399 تستخدم لتصفية بروتين MAP65 من حبات النيكل لتنقية MAP65 Kimwipes Fisher 34155 للتنظيف وسحب المحاليل من خلال الغرف التجريبية.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M في ddH2O ، طازج لمنع التحمض بمرور الوقت.</td></tr><tr><td>غاز النيتروجين السائل</td><td></td><td>NI 230LT22</td><td>لإسقاط كميات التجميد. يمكن استخدام هذا أيضا للتخزين (غير مستحسن)</td></tr> <tr><td>بروتين MAP65</td><td>رام ديكسيت</td><td></td><td>بروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة (MAP) بوزن جزيئي يبلغ 65 كيلو دالتون وهو عبارة عن رابط متشابك مضاد للأنابيب الدقيقة. لقد قمنا بتنقية نسخة غير مصنفة وتحمل علامة GFP من MAP65-1 من نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا. نقوم بخلط GFP-MAP65 مع MAP65 غير المسمى بحيث يتم تسمية 10٪ من البروتين. المخزون العامل هو 10.8 & mu. حل M. يتم تخزين حل العمل هذا في 4 درجة ؛ C وإعادة صنعها طازجة كل أسبوع. تم تقديم بروتوكول لتنقية MAP65 و GFP-MAP65 في الفصل (26) من الطرق السابقة.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>MKCJ940</td><td>Tubulin مكون عازلة</td></tr><tr><td>NTA-Nickel حبات</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>الخرز المطلوبة لتنقية 6xHis الموسومة MAP65 البروتينات</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td><td>نيكون</td><td></td><td>405 نانومتر نظام الليزر الذي يمكنه تركيز الليزر في أي شكل مرغوب فيه من منطقة الاهتمام</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>عازلة قاعدة بلمرة التوبولين المحايدة للمحلول المصنوع من أنابيب K 80 ملي متر ، درجة الحموضة 6.8 ، 1 ملي مولار MgSO4 ، 1 ملي مولار EGTA ، مخزنة عند 4& درجة ؛ C لمدة تصل إلى عام واحد.</td></tr><tr><td>شريط دائم على الوجهين</td><td>3M - سكوتش</td><td>34-8724-5691-7</td><td>للغرف التجريبية</td></tr><tr><td>طبق بتري</td><td>فيشر</td><td>FB0875713</td><td>للغرفة الرطبة</td></tr><tr><td>الأنابيب</td><td>المكون</td><td></td><td>الأساسي للعازلة Tubulin</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>كتلة كوبوليمر مع كتلتين من أكسيد البولي إيثيلين المحبة للماء (PEO) على الأطراف وكتلة مركزية كارهة للماء من طلاء السطح الكارهة للماء بأكسيد البولي فينيلين (PPO) نستخدمها لمنع ارتباط البروتين بالسطح. يتم شراء Pluronic-F127 كمسحوق (Sigma) ويتم إذابته إلى محلول 5٪ (وزن / حجم) في ddH2O بين عشية وضحاها. بمجرد الذوبان ، يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى عام واحد.</td></tr><tr><td>البولي إيثيلين جلايكول</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>عامل مزدحم يستخدم لخلق قوى استنفاد لجلب التكتويدات إلى السطح والمساعدة في تنظيم الأنابيب الدقيقة. نقوم بإنشاء حل 5٪ (وزن / حجم) من 100 كيلو دالتون PEG في PEM80. يتم تخزين المحلول في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى عام واحد وتوضع على الروك قبل الاستخدام. إنها لزجة، لذلك نوصي باستخدام ماصة الإزاحة الإيجابية للعمل معها.</td></tr><tr><td>ماصة الإزاحة الإيجابية</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>لسحب السوائل اللزجة</td></tr><tr><td>رفوف للأغطية علوم</td><td>المجهر الإلكتروني</td><td>72240</td><td>لإعداد الغرف التجريبية - معالجة نظارات الغطاء</td></tr><tr><td>ثلاجة 4 درجة ؛ C</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>لتخزين الكواشف</td></tr><tr><td>Tubulin المسمى</td><td>الهيكل الخلوي</td><td>TL590M</td> يتم <td>شراء tubulin المجفف بالتجميد المسمى الرودامين من دماغ الخنزير (الهيكل الخلوي) وتخزينه في -80 درجة ؛ C حتى يصبح رطبا في PEM80 ويستخدم لمدة تصل إلى عام واحد.</td></tr><tr><td>يتم شراء بروتين التوبولين</td><td>الهيكل الخلوي</td><td>T240</td><td>التوبولين المجفف بالتجميد 99٪ نقي غير مصنف من دماغ الخنزير (الهيكل الخلوي) وتخزينه في -80 درجة ؛ C حتى يصبح رطبا في PEM80 ويستخدم لمدة تصل إلى عام واحد.</td></tr><tr><td>UV-Ozone</td><td>Jelight</td><td>Model 342</td><td>لإعداد الغرف التجريبية - معالجة نظارات</td></tr><tr><td>الغطاء Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>البرنامج المساعد لتسجيل بيانات السلاسل الزمنية لإزالة الانجراف</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging</td><td>Group http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> البرنامج <td>المساعد لتسجيل بيانات السلاسل الزمنية لإزالة الانجراف</td></tr></tbody></table>

التجميع الذاتي لل tactoids microtubule

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

الهيكل الخلوي هو المسؤول عن التنظيم الداخلي الرئيسي وإعادة التنظيم داخل الخلية ، وكل ذلك بدون مدير لتوجيه التغييرات. هذا هو الحال بشكل خاص أثناء الانقسام أو الانقسام الاختزالي ، حيث تشكل الأنابيب الدقيقة المغزل أثناء انقسام الخلايا. المغزل هو الآلية المستخدمة لفصل المواد الوراثية أثناء انقسام الخلايا. نحو إنشاء مغزل ذاتي التنظيم في المختبر ، قمنا مؤخرا بتطوير تقنية لإعادة تشكيل الأنابيب الدقيقة في مجموعات تشبه المغزل مع الحد الأدنى من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة وعوامل الازدحام. على وجه التحديد ، تم استخدام MAP65 ، وهو رابط متقاطع مضاد للأنابيب الدقيقة من النباتات ، وهو تجانس Ase1 من الخميرة و PRC1 من الكائنات الحية الثدييات. يقوم هذا الوصلة المتقاطعة بتنظيم الأنابيب الدقيقة ذاتيا في مجموعات طويلة ورقيقة تشبه المغزل ذاتية التنظيم للأنابيب الدقيقة. تشبه هذه التجميعات أيضا اللباقات البلورية السائلة ، ويمكن استخدام الأنابيب الدقيقة كميزوجينات متوسطة الحجم. هنا ، يتم تقديم بروتوكولات لإنشاء هذه اللباقات microtubule ، وكذلك لتوصيف شكل التجميعات باستخدام الفحص المجهري الفلوري وحركة المكونات باستخدام استرداد التألق بعد التبييض الضوئي.

مع وجود عدد قليل فقط من المكونات ، و tubulin dimers ، و microtubule crosslinkers ، يمكن أن تتشكل tactoids microtubule (الشكل 2A). على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف الحضانة للنوى وتنمو الأنابيب الدقيقة في الحاضنة ، إلا أنه يمكن ملاحظة النوى والنمو مباشرة تحت المجهر (والتي تكتمل في غضون 30 دقيقة) (الشكل 2B). يتم الاحتفاظ بتركيز التوبولين ثابتا عند 13.6 ميكرومتر وربط MAP65-MT عند 10٪.
ويمثل الشكل 4 بيانات ناجحة. يجب أن تكون اللباقات مرئية مع كل من ليزر 561 نانومتر في قناة توبولين و 488 نانومتر في قناة MAP65 ، والتي تتداخل تماما مع بعضها البعض (الشكل 4A). كان أحد ألغاز النظام هو أن عرض اللباقات لا يبدو أنه يختلف في ظل مجموعة متنوعة من التغييرات التجريبية ، بما في ذلك تغيير أطوال الأنابيب الدقيقة ، وتركيز MAP65 ، وعوامل الازدحام (الشكل 4B) 22,28. الطول أكثر تغيرا بكثير ويعتمد على كل من أطوال الأنابيب الدقيقة وتركيز MAP65 (الشكل 4B)22,28.
عند إجراء FRAP ، لوحظ أن إشارة MAP65 تتعافى ، لكن إشارة microtubule لا تتعافى (الشكل 5). يرجع الانتعاش في FRAP إلى حركة وحركة الكائنات الموسومة والمبيضة ضوئيا. في حالة MAP65 ، تنفصل الجزيئات المظلمة وتبتعد عن الأنابيب الدقيقة وتنتقل جزيئات جديدة إلى المنطقة (الشكل 5). يكون ربط MAP65 في حالة توازن ، وبالتالي فإن معدل الربط وغير الارتباط متساو (يقاس بالجزيئات في الثانية). بالنسبة للأنابيب الدقيقة ، لم يلاحظ أي استرداد مما يعني أن الأنابيب الدقيقة غير قادرة على مغادرة التاكتويد (الشكل 5A ، Bi ، C). علاوة على ذلك ، لم يلاحظ أي انتشار للمنطقة المظلمة ، مما يشير إلى أن الأنابيب الدقيقة غير متحركة محليا وليست سائلا داخل الشكل اللمسي.
<img alt="محاذاة الكروموسوم Metaphase. هيكل المغزل وتنظيم الأنابيب الدقيقة ؛ مخطط الفحص المجهري." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> الشكل 1: نماذج مختلفة من تشكيل المغزل. المغزل الانقسامي هو آلة مصنوعة من الأنابيب الدقيقة والبروتينات والإنزيمات المرتبطة بها التي تحاذي وتفصل الكروموسومات إلى خليتين ابنتين جديدتين أثناء انقسام الخلايا. (أ) صورة لنسخة طبق الأصل من مغزل الإسقاط في أوائل العصور الوسطى مع خيوط دقيقة من هولندا. تم تعديل هذا الرقم من صورة ويكيميديا بواسطة بيتر فان دير سلويجس30. (ب) إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للأنابيب الدقيقة في مراحل مختلفة من الانقسام الاختزالي البري الثاني. تظهر الأنابيب الدقيقة باللون الأخضر ، وتظهر الكروموسومات باللون الرمادي. شريط المقياس = 1 ميكرومتر. وقد عدل هذا الرقم من Lantzsch et al.31. (ج) صورة مجهرية للأنابيب الدقيقة في مغزل انقسامي لخلية Sf9 المنقسمة. يتم تصنيف أقطاب المغزل والأنابيب الدقيقة للمغزل ببروتين فلورسنت أخضر. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. وقد عدل هذا الرقم من Advani et al.32. (د) نماذج مختلفة لكيفية تنظيم الأنابيب الدقيقة المغزل الانقسامية والانقسامية. (ط) لوحظ سابقا بالنسبة للمغزل الوسيط المصنوع من مستخلصات بيض زينوبوس، أن الأنابيب الدقيقة (الخضراء) كانت قصيرة وديناميكية في جميع أنحاء المغزل. هذا مشابه لتنظيم تاكتويد ثنائي القطب داخل بلورة سائلة. (ii) يحتوي النموذج القانوني لتنظيم الأنابيب الدقيقة داخل المغزل الانقسامي على نوعين من الأنابيب الدقيقة: الأنابيب الدقيقة بين الأقطاب أو القطبية (الأخضر الداكن) التي تتقاطع في المنطقة الوسطى حول الكروموسومات والأنابيب الدقيقة الحركية (الأخضر الفاتح) التي يتم تجميعها وتمتد من القطب إلى الكينيتوخور لدفع وسحب الكروموسومات. في جميع الصور ، تظهر الكروموسومات باللون الأزرق الشفاف ، ويتم تمثيل أقطاب المغزل باللون الأخضر الداكن. (ه) مخططات الميزوجينات (الخطوط الخضراء) في تاكتويد بلورة سائلة ل (i) ثنائي القطب و (ii) tactoids متجانسة. تحتوي اللباقات ثنائية القطب على قطبين في نهاية اللباقة ، وتعيد الميزوجينات توجيهها للإشارة إلى هذين القطبين. تحتوي اللباقات المتجانسة على أقطاب عند ما لا نهاية ، ولا تغير الميزوجينات اتجاهها على طول اللباقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="طريقة تشكيل التباق التخطيطية والسلاسل الزمنية. الأنابيب الدقيقة ، التشابك MAP65 ، الفحص المجهري." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> الشكل 2: تكثيف الأنابيب الدقيقة . (أ) يمكن تجميع الأنابيب الدقيقة وترابطها بمجموعة متنوعة من الطرق بما في ذلك الأنواع الأيونية ، وقوى النضوب الناجمة عن عوامل الازدحام ، والروابط المتقاطعة المحددة للأنابيب الدقيقة ، مثل MAP65. (ط) يتم خلط بروتينات توبولين دايمرات وبروتينات MAP65 لنواة وزراعة الأنابيب الدقيقة. (ii) تنوي الأنابيب الدقيقة وتنمو من التوبولين ، ويرتبط MAP65 على الفور بالأنابيب الدقيقة ، أو مونومر MAP65 آخر ، أو كليهما ويسبب التجميع. (iii) الأنابيب الدقيقة في الحزم المتقاطعة نواة وتنمو. (iv) التكوين النهائي هو tactoid microtubule مماثلة للمغزل. (ب) السلاسل الزمنية لكتل الأنابيب الدقيقة التي تنوي وتنمو أكثر من 105 دقائق. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. () الشكل مقتبس من Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="مخطط غرفة التدفق مع غطاء سيلان ، لتحليل اتجاه تدفق العينة في الفحص المجهري." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> الشكل 3: تجميع غرفة التدفق. تصنع غرفة التدفق باستخدام شريحة زجاجية وزجاج غطاء مائل وشريط دائم على الوجهين. المنطقة الصفراء المميزة هي مسار التدفق حيث يتم تدفق العينة ومراقبتها. حجم غرفة التدفق هو ~ 20 ميكرولتر. تم استخدام الإيبوكسي لإغلاق نهايات الغرفة لمنع العينة من التبخر أثناء التصوير على المدى الطويل على مدى عدة ساعات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="تحليل التباق: قنوات الأنابيب الدقيقة و MAP65 ، الصور المدمجة ، القياس الكمي للطول والعرض ، الرسم البياني." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> الشكل 4: الصور اللصيقة وتحليل الطول والعرض. (أ) مثال على بيانات اللكتل التي تشكلت على النحو الموصوف والمصور باستخدام قرص دوار متحد البؤرة يظهر (i) قناة microtubule تصوير التوبولين المسمى بالرودامين باستخدام ليزر 561 نانومتر ، (ii) قناة GFP-MAP65 التي تصور GFP باستخدام ليزر 488 نانومتر ، و (iii) صورة تراكب مدمجة من قناة microtubule (أرجواني) وقناة GFP-MAP65 (سماوية). يتم عرض مناطق التداخل باللون الأبيض وتوضح أن الأنابيب الدقيقة و MAP65 تتداخل بالضبط. شريط المقياس = 10 ميكرومتر لجميع الصور في (A). (ب) التحديد الكمي لطول وعرض التاكتويد. (ط) صورة لأداة تاكتويد ليتم تحليلها بدون تسميات. شريط المقياس = 5 ميكرومتر (ii) نفس الصورة كما في (i) ، حيث يتم الإشارة إلى قياسات الطول (الخط الصلب مع أغطية الخط) والعرض (الخط المتقطع). شريط المقياس = 5 ميكرومتر (iii) تم قياس العرض عن طريق أخذ ملف تعريف الشدة عبر التاكتويد عند القطاع الثنائي العمودي (الخط المتقطع) المشار إليه في (ii). كان ملف تعريف الكثافة مناسبا لدالة غاوسية للكشف عن سعة وعرض اللباقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="تحليل FRAP: الأنابيب الدقيقة ، السلاسل الزمنية MAP65 ، مخططات الكثافة. ديناميكيات استعادة التألق." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> الشكل 5: بيانات وتحليل FRAP التمثيلي. (أ) بيانات السلاسل الزمنية للمجهر ل (i) tactoid microtubule و (ii) GFP-MAP65 ، و (iii) صورة تراكب لكلتا القناتين مع microtubules باللون الأرجواني و GFP-MAP65 باللون السماوي التي تم تبييضها ضوئيا في الوقت 63 s ولوحظت لمدة 5 دقائق إضافية (B) كثافة كميا ل (i ) قناة الأنابيب الدقيقة في المنطقة المبيضة (الدوائر الأرجوانية) والخلفية (الدوائر الرمادية الداكنة) و (ii) قناة GFP-MAP65 في المنطقة المبيضة (المربعات السماوية) والخلفية (المربعات الرمادية الداكنة). (ج) تم تصحيح البيانات لضوضاء الخلفية وإعادة قياسها لقناة الأنابيب الدقيقة (الدوائر الأرجوانية) وقناة GFP-MAP65 (المربعات السماوية). لا تتعافى الأنابيب الدقيقة ، لكن GFP-MAP65 يفعل ويمكن أن يكون مناسبا (الخط الرمادي الداكن) للاضمحلال الأسي المتزايد للعثور على سعة وجدول زمني للاسترداد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لتشكيل تجمعات الأنابيب الدقيقة على شكل تاكتويد باستخدام MAP65 ، وهو رابط متقاطع للأنابيب الدقيقة نباتي ، و PEG كعامل ازدحام.

التجميع الذاتي لل Tactoids microtubule

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

يتيح هذا البروتوكول التنظيم الذاتي التلقائي لكتل الأنابيب الدقيقة باستخدام رابط متقاطع مضاد للتوازي ، MAP65. يمكن أن يساعدنا هذا النظام على فهم تنظيم الأنابيب الدقيقة والأنظمة البيولوجية مثل المغزل الانقسامي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نظام بسيط يمكنه إعادة إنشاء أشكال تشبه المغزل للأنابيب الدقيقة القابلة للتكرار بشكل كبير ويمكن الوصول إليها من قبل العديد من المختبرات.هذه الطريقة لا تنطبق فقط على الأنظمة الخلوية ، ولكن يمكن أن تكون أيضا بمثابة نموذج لدراسات البلورات السائلة متوسطة النطاق. لتحضير التوبولين ، أخرج أولا أليكوت من التوبولين غير المسمى الذي يحتوي على ملليغرام واحد من التوبولين المجفف بالتجميد من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر واحتفظ به على الجليد. ثم أضف 200 ميكرولتر من PEM-80 البارد.لإذابة كل الليوفيلات ، احتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أخرج أنبوبا من التوبولين المسمى بالرودامين يحتوي على 20 ميكروغرام من مسحوق التوبولين المجفف بالتجميد من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر واحتفظ به على الجليد. ثم ، أضف أربعة ميكرولترات من PEM-80 البارد واحتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق لإذابة كل الليثوفيلات.بمجرد أن تذوب التوبولين المجمدة بالتجميد ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التوبولين المعاد تعليقه غير المسمى إلى محلول التوبولين المسمى بالرودامين المكون من أربعة ميكرولترات. ثم ، امزج المحاليل عن طريق الأنابيب من ست إلى سبع مرات ببطء شديد. لتخزين ال 100 ميكرولتر المتبقية من محلول التوبولين غير المسمى ، أولا ، أدخل الأنبوب في النيتروجين السائل لتجميد المحلول ، ثم احتفظ بالأنبوب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للاستخدام في المستقبل.بعد ذلك ، قم بتوزيع مزيج التوبولين في سبعة أنابيب جديدة بإضافة 15 ميكرولتر في كل منها. قم بتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل كما هو موضح سابقا وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها في المستقبل. لتجميع غرف التدفق لإجراء التجارب ، أولا ، قم بتنظيف شريحة زجاجية بالماء المقطر المزدوج وجففها بمسح مختبري خال من الوبر.بعد ذلك ، قم بتنظيف الشريحة أولا باستخدام الإيثانول متبوعا بالماء المقطر المزدوج. لإنشاء مسار تدفق، قم بقص قطعة من الشريط على الوجهين بطول 40 إلى 50 ملم. ثم ، قم بتقسيمه بينهما لإنشاء شريطين أرق من الشريط ووضع الشريطين على الشريحة على بعد خمسة إلى ثمانية ملليمترات.بعد ذلك ، ضع زلات الغطاء المائلة أعلى مسار التدفق. بعد ذلك ، قم بإغلاق الشريحة والغطاء الذي تم انزلاقه شرائط الشريط على الوجهين عن طريق الضغط برفق على منطقة الشريط باستخدام الجزء الخلفي من القلم. إذا كان الختم مصنوعا بشكل جيد ، فيجب أن يتحول الشريط من شفاف إلى واضح.لإزالة الشريط الإضافي على الحواف ، قم بقص الشريط بشفرة حلاقة ، تاركا ملليمترا واحدا فقط من مدخل غرفة التدفق. بعد ذلك ، قم بتسمية الغرفة بمعلمات تجريبية مناسبة لإجراء تجارب tactoid ، أولا ، قم بإذابة جميع الكواشف اللازمة على الجليد وتخزينها على الجليد أثناء العمل. بعد ذلك ، قم بتغطية غرفة التدفق ب 20 ميكرولتر من 5٪ من الفاعل بالسطح من البوليمر المشترك غير الأيوني المذاب في PEM-80 مع قطرات صغيرة في طرفي الغرفة لمنع تكوين فقاعات الهواء في الداخل.بعد ذلك ، احتفظ بغرفة التدفق في غرفة رطبة مصنوعة من طبق بتري مع مسح مختبري رطب خال من الوبر لمدة خمس إلى سبع دقائق على الأقل. بعد ذلك ، امزج PEM-80 و GMPPPPPP و Pluronic F-127 و dithiothreitol و glucose و polyethylene glycol ومزيج tubulin المصنوع في وقت سابق و MAP65 مع GFP MAP65 للتصور في أنبوب معقم عن طريق السحب من خمس إلى ست مرات ، مع الحفاظ على الأنبوب على الجليد. ثم ، أضف ميكرولتر واحد من محلول مخلوط مسبقا من أوكسيديز الجلوكوز والكاتالاز في أنبوب خليط tubulin-MAP واخلطه مرة أخرى عن طريق الأنابيب من سبع إلى ثماني مرات.قسم الحجم الإجمالي للمحلول إلى جزأين لاستخدامهما في غرف منفصلة. وفي الوقت نفسه ، يجب إزالة السائل المضاف سابقا إلى غرفة التدفق عن طريق العمل الشعري باستخدام مسح مختبري خال من الوبر في الطرف الآخر من الغرفة ، إلى جانب إضافة مزيج tubulin-MAP إلى غرفة التدفق. بمجرد أن تكون العينة داخل الغرفة بالكامل ، قم بإغلاق طرفي الغرفة باستخدام الإيبوكسي لمدة خمس دقائق واحتفظ بها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا لنواة ونمو تاكتويد الأنابيب الدقيقة.لتصوير اللباقات بواسطة المجهر الفلوري ، استخدم الأهداف ذات الفتحة العددية 1.2 أو أكثر في تكبير 60X أو أعلى لجمع ما يكفي من الضوء في التألق. سجل الصور باستخدام أشباه الموصلات المعدنية المجانية أو كاميرا جهاز مقترنة بالشحن. للحفاظ على العينة، احتفظ بها في غرفة بيئية محددة عند 37 درجة مئوية.بدلا من ذلك ، يمكن استخدام سخانات المرحلة الأخرى ، بما في ذلك سخانات مرحلة الهواء الساخن والياقات الموضوعية التي يتم التحكم في درجة حرارتها مع الماء الدافئ المتداول ، لهذا الغرض. نظرا لأن مصادر الإثارة المناسبة ضرورية للتألق الصحيح لتوبولين الرودامين ، استخدم ليزر 561 نانومتر مع مللي واط واحد على الأقل من الطاقة في العينة للحصول على صور عالية الجودة. ومع ذلك ، بالنسبة ل GFP MAP65 ، قم بتغيير مصدر الإثارة إلى ليزر 488 نانومتر.إذا كنت تستخدم مجهر epifluorescence واسع المجال ، فاستخدم مكعب مرشح الرودامين مع إثارة 540 12.5 نانومتر ، وثنائي اللون من 545 نانومتر 12.5 نانومتر قطع ، وانبعاث 575 نانومتر طويل التمرير. بالنسبة ل GFP MAP ، استخدم مكعب مرشح GFP مع إثارة 480 15 نانومتر ، وثنائي اللون من 505 نانومتر 15 نانومتر مقطوع ، وانبعاث 515 نانومتر طويل الممر. بعد التأكد من أن قوة الإضاءة وأوقات التعرض ليست مشبعة بمقياس كثافة الكاميرا ، التقط ما لا يقل عن 10 صور لمناطق مختلفة لتصوير أكثر من 100 تاكتويد في كل من القنوات الحمراء والخضراء ، واحفظها كصور TIFF 16 بت للتحليل.باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تصور تاكتويد الأنابيب الدقيقة التي يكتمل تكوينها في غضون 30 دقيقة مباشرة تحت المجهر. يمكن رؤية اللباقات باستخدام كل من ليزر 561 نانومتر في قناة توبولين وليزر 488 نانومتر في قناة MAP65. الصور أيضا تتداخل تماما مع بعضها البعض.في هذه الطريقة ، يمكن قياس طول وعرض tactoids كذلك. تم العثور على ملف تعريف كثافة tactoid يختلف مع عرضه. علاوة على ذلك ، تم إثبات الطبيعة غير المتحركة لكتل الأنابيب الدقيقة من خلال استعادة التألق بعد تجارب التبييض الضوئي أو FRAP ، والتي لم تظهر أي استرداد للتألق بعد التبييض الضوئي.من ناحية أخرى ، كشفت تجارب FRAP عن طبيعة متنقلة ل MAP65 ، والتي يمكن ملاحظة الانتعاش التدريجي والتألق بعد التبييض الضوئي. يمكن أن يكون هذا الانتعاش الفلوري بواسطة MAP65 مناسبا للاضمحلال الأسي المتزايد للعثور على السعة والنطاق الزمني للانتعاش. يجب إكمال جزء التجربة اللمسية في غضون 10 إلى 12 دقيقة ، حيث يمكن أن يسوء التوبولين على الجليد بسرعة ، مما قد يكون ضارا بنواة اللاكتويدات.وسيستمر العمل المستقبلي مع مختلف البروتينات المتقاطعة للأنابيب الدقيقة والبروتينات الحركية المترابطة ، وهي إنزيمات يمكنها تحريك الأنابيب الدقيقة ، في الكشف عن معلومات جديدة حول التنظيم الذاتي للمغزل الانقسامي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

يصف هذا الفيديو TIRF ، وهي تقنية قائمة على الفحص المجهري الانعكاس الداخلي الكلي لتصور ديناميكيات بلمرة الأكتين والأنابيب الدقيقة. تسمح الطريقة بالتصوير عالي الدقة لديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في الوقت الفعلي ، وهو أمر ضروري لفهم الحديث المتبادل الخلوي.

الفحص المجهري TIRF لتصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة

الأنابيب الدقيقة هي بطبيعتها غير مستقرة البوليمرات، والتبديل ما بين النمو والسمن العشوائية ويصعب السيطرة عليها. نحن هنا تصف البروتوكولات باستخدام الأنابيب الدقيقة مجزأة مع قبعات استقرار photoablatable. يمكن أن تسبب التحلل من الأنابيب الدقيقة مجزأة مع القرار الزماني والمكاني عالية، مما يساعد تحليل الاقتراحات مع نهايات أنيبيب تفكيك.

إعداد مقسمة ميكروتثبول لدراسة الاقتراحات وانطلاقا من تفكيك أنيبيب ينتهي

هنا ، يتم تقديم فحص إعادة تشكيل مجهري TIRF قائم على المختبر لتحديد ومقارنة ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة في وقت واحد. يتم وصف طريقة لعرض النشاط الجماعي للبروتينات المتعددة المرتبطة بالأنابيب الدقيقة في وقت واحد على حزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والأنابيب الدقيقة المفردة.

التصور المتزامن لديناميكيات الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والمفردة في المختبر بواسطة مجهر TIRF

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعادة تشكيل حزم الأنابيب الدقيقة في المختبر وتحديد القوى التي تمارس داخلها مباشرة باستخدام الاصطياد البصري المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي. يسمح هذا الفحص بقياس القوى والإزاحات الناتجة عن مجموعات البروتين داخل شبكات الأنابيب الدقيقة النشطة على مستوى النانو.

قياس القوى مباشرة داخل حزم الأنابيب الدقيقة النشطة المعاد تشكيلها

هذا البروتوكول هو دليل لتصور الأكتين الديناميكي والأنابيب الدقيقة باستخدام الفحص المجهري الداخلي الكلي للتألق في المختبر (TIRF).

تصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر بواسطة المجهر الكلي للتألق الداخلي (TIRF)

يتم تقديم طرق لإعداد النيماتكس النشطة من الأنابيب الدقيقة ومحركات kinesin ، بما في ذلك تحضير البروتين وبنائه واستخدام الآبار للحبس النيماتيكي النشط.

تشكيل وحصر ومراقبة النيماتكس النشطة القائمة على الأنابيب الدقيقة

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولات موحدة لقياس هايبرفوسفوريليشن تاو، قياس ملزمة تاو microtubules، وتوطين تاو داخل الخلايا بعد العلاج بالعقاقير. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات متكررة لفحص المخدرات أو غيرها من المركبات التي تستهدف الربط تاو هايبرفوسفوريليشن أو ميكروتوبولي.

والرزن الفسفرة وملزمة Microtubule جنبا إلى جنب مع تعريب بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

ويرد في هذه الورقة، طريقة لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس بيرميبيليزيد من المورفولوجية. هذا الأسلوب يتطلب مقداراً قليلاً من الأنسجة مقارنة بتقنية عزل المتقدرية الكلاسيكية وما تحقق من النتائج ذات صلة أكثر فسيولوجيا.

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

نقدم هنا بروتوكولا مورين في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي مع البيوتين. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين الفائدة.

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

ونحن نقدم وصفا للبروتوكولات الخاصة بتحديد هيكل المجال الملزم IKK من نيمو بواسطة البلورات بالاشعه السينية. وتشمل الأساليب التعبير البروتين, تنقيه وتوصيف وكذلك استراتيجيات لتحسين الكريستال الناجحة وهيكل تحديد البروتين في شكله غير منضم.

الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو

اكتشف طريقة تكوين التكتويدات الميكروتوبولية ذاتياً باستخدام MAP65 وPEG لفهم تنظيم الميكروتوبولات في الأنظمة البيولوجية مثل مغازل الانقسام. هذه التقنية قابلة للتكرار وتساعد الباحثين على دراسة الديناميات الخلوية بدقة عالية.

التجميع الذاتي لل Tactoids microtubule

استكشف المزيد من الفيديوهات