نهج ديناميكي ضوئي لدراسة وظيفة تمزق الحويصلة داخل الخلايا

يؤدي التداخل الخلوي للحويصلة إلى التنسج الخلوي إلى تكوين حويصلات داخل الخلايا. نفاذية الحويصلة ينشط مسارات الإشارة المختلفة. يستخدم تعطيل الليزر بمساعدة الكروموفور لدراسة عواقب تمزق الحويصلة داخل الخلايا.

يمكن تحقيق التحكم المكاني والزماني في الأضرار تحت الخلوية للحويصلات داخل الخلايا عن طريق ضبط حالة الوقوف وإضاءة الضوء. للبدء ، حافظ على زراعة خلايا HeLa في DMEM مع 10٪ FBS. بعد غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ، التربسين الخلايا.

ثم أعد تعليق الخلايا في DMEM المكملة ب 10٪ FBS. تمييع 300 نانوجرام من بلازميد Gal3-GFP في 25 ميكرولتر من وسط المصل المخفض. ثم أضف 0.6 ميكرولتر كاشف P3000.

وتخلط بلطف ، تليها دوامة الحل. تمييع 0.45 ميكرولتر من كاشف Lipofectamine 3000 في 25 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض وتخلط بلطف. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم امزج الحمض النووي المخفف و Lipofectamine 3000 المخفف واحتضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خلط خليط الحمض النووي ليبوفيكتامين ، 300،000 خلية هيلا معلقة و 200 ميكرولتر من DMEM مع 10٪ FBS ، قم بزرع الخلايا في المنطقة الزجاجية المركزية لطبق زر زجاجي 35 ملم. للسماح بربط الخلية ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الحاضنة المزودة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات على الأقل.

تمييع AlPcS2a في DMEM المكمل ب 10٪ FBS لصنع محلول AlPcS2a ميكرومولار واحد. سخن الوسط المحتوي على AlPcS2a في حمام مائي 37 درجة مئوية واستبدل وسط الاستزراع بالوسط المحتوي على AlPcS2a. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الحاضنة المزودة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة AlPcS2a خارج الخلية بعد استبدال الوسط بوسط جديد. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات للسماح للصبغة المتبقية على طول المسار الداخلي بالتراكم في الجسيمات الحالة. لمعالجة الخلايا المفردة عن طريق إتلاف الليزوزومات ، ضع طبق الثقافة على مرحلة المجهر متحد البؤر.

استخدم ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر لإثارة GFP و AlPcS2a ، على التوالي. ضع دائرة حول منطقة مربعة مساحتها خمسة في خمسة ميكرومتر ذات أهمية على الحويصلات المسماة AlPcS2a والتي تم اختيارها للتلف. ثم تضيء النبضة المنطقة محل الاهتمام باستخدام ليزر 633 نانومتر من 0.21 ملي واط ، أو 70 تكرارا.

مراقبة تشكيل Gal3 puncta كمؤشر على نفاذية الغشاء الليزوزومي. تم إجراء تلطيخ الليزوزومات باستخدام AlPcS2a في خلايا HeLa باستخدام علامات متاحة تجاريا ، وتم تلطيخها بشكل إيجابي بصبغة الفلورسنت الخضراء. تم تلطيخ الليزوزومات في TagRFP-Galectin3 المعبر عن خلايا هيلا باستخدام AlPcS2a.

بعد تركيز الإضاءة بضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة ، تشير النتائج إلى أن تعطيل الليزر بمساعدة الكروموفور القائم على AlPcS2a كان قادرا على التحكم في تمزق الليزوزومات المحلية داخل المنطقة محل الاهتمام ، تاركا بقية الجسيمات الحالة سليمة. هذه الخطوة مهمة لأن وقت الحضانة سيحدد الإندوسومات الدائمة أو الليزوزومات. على سبيل المثال ، يمكن للناس تحديد حجم عن طريق إطلاق صبغة غير منفذة للغشاء.

كما يمكن استخدام الأصباغ الحساسة لدرجة الحموضة مثل FITC ديكستران للفرق endosomes والليزوزومات. هذه التقنية مفيدة لبدء التأثيرات النهائية لتمزق غشاء الحويصلة داخل الخلايا. وهناك تأثيرات المصب في ظل حالات مختلفة.