الفحص الجيني لتحديد مثبطات النسخ المتعددة في Schizosaccharomyces pombe

يصف هذا العمل بروتوكولا للشاشة الجينية المثبطة متعددة النسخ في Schizosaccharomyces pombe. تستخدم هذه الشاشة مكتبة بلازميد على نطاق الجينوم لتحديد استنساخ (نسخ) مثبط لنمط ظاهري مفقود الوظيفة مرتبط بسلالة متحولة للاستعلام. تم تحديد مثبطات جينية جديدة للمتحور الفارغ ell1 باستخدام هذه الشاشة.

تحدد الشاشات المثبطة التفاعلات الجينية التي من شأنها أن تلقي الضوء على وظائف الجين محل الاهتمام وكذلك المسارات والعمليات البيولوجية التي قد تشارك فيها في الجسم الحي. يمكن لهذه التقنية تحديد العلاقة الجينية بين منتجين جينيين ربما لم يتم إثباتهما باستخدام أساليب أخرى. يمكن توسيع نتائج هذه الشاشات في الخميرة لتشمل الكائنات الحية حقيقية النواة العالية ، حيث يتم الحفاظ على معظم المسارات والعمليات البيولوجية الأساسية عبر التطور.

يعتمد نجاح المخطط على توافر جودة عالية وكفاءة عالية لتحويله إلى خلايا خميرة. وبالتالي ، فإن بروتوكول التحويل مع البلازميد قبل أن ينمو سلالة حذف Schizosaccharomyces pombe ell1 عند 32 درجة مئوية على لوحة YE المتوسطة. خذ حلقة مليئة بسلالة ell1 المتحولة من الصفيحة ، وقم بتلقيح خمسة ملليلترات من وسط YE المكمل ، ثم احتضن القارورة أثناء الاهتزاز عند 32 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

بعد الحضانة ، قم بتخفيف ثقافة النمو بين عشية وضحاها في 100 ملليلتر من وسط YE الطازج الذي يحتوي على المكملات الغذائية المطلوبة لتحقيق 0.3 كثافة بصرية عند 600 نانومتر. احتضن الوسط عند 32 درجة مئوية بينما يهتز عند 200 إلى 550 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى مرحلة منتصف السجل. بعد تقسيم 100 ملليلتر من الثقافة إلى أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي سعة 50 ملليلتر ، قم بتكوير الخلايا عند 4000 مرة من G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد التخلص من السوبرناتانت ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من الماء المعقم. جهاز طرد مركزي وتخلص من supernatant مرة أخرى ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من خلات الليثيوم TE. بيليه الخلية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق كل بيليه خلية في 250 ميكرولتر من خلات الليثيوم TE. بعد ذلك ، انقل 125 ميكرولتر من الخلايا المختصة إلى أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة مختلفة لخطوات التحويل اللاحقة. غلي الحمض النووي الناقل من خصيتي السلمون أو الحيوانات المنوية الرنجة لمدة دقيقة واحدة ووضع الأنبوب على الفور على الجليد.

لكل تحول ، أضف 10 ميكرولترات من الحمض النووي الناقل أحادي الخيط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على 125 ميكرولتر من الخلايا المختصة واخلطه بلطف عن طريق السحب. بعد ذلك ، أضف 50 ميكروغرام من مكتبة Schizosaccharomyces pombe cDNA إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا مختصة وخليط الحمض النووي الناقل. بعد احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، أضف 260 ميكرولتر من محلول خلات البولي إيثيلين جليكول ليثيوم واخلطه عن طريق السحب.

احتضان الأنبوب الذي يحتوي على خليط التحويل عند 32 درجة مئوية لمدة ساعتين دون اهتزاز. أضف 43 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ثنائي ميثيل المسخن مسبقا إلى الأنبوب واخلطه بلطف. الآن ، قم بتعريض الأنبوب لصدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بتكسير الخلايا وتخلص من المادة الفائقة كما هو موضح سابقا ثم قم بإخراج محلول البولي إيثيلين غليكول أسيتات الليثيوم المتبقي TE. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الماء المعقم وقم بوضعها على صفيحة EMM2 واحدة تحتوي على المكملات الغذائية المطلوبة و 0.2 ميكروغرام لكل ملليلتر من 4-NQO. ثم ، اسمح للمستعمرات بالظهور على الألواح عن طريق احتضان الألواح عند 32 درجة مئوية لمدة خمسة إلى ستة أيام.

لمزيد من الفحص ، قم بربط المستعمرات التي تم الحصول عليها على نفس اللوحة المتوسطة في وجود 0.2 ميكروغرام لكل ملليلتر من 4-NQO. لتجربة تحويل مكتبة واحدة ، استخدم 500 ميكرولتر من الخلايا المختصة للتحويل ولوحة 1 × 10 من خليط التحويل على لوحة EMM2 مع المكملات المطلوبة التي تفتقر إلى 4-NQO لحساب العدد الإجمالي لاستنساخ المكتبة التي تم الحصول عليها بعد التحويل وفحص استنساخ المثبط. أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من الماء المعقم إلى كل بئر من صفيحة ميكروتيتر معقمة مكونة من 96 بئرا.

باستخدام مسواك معقم أو طرف ماصة ميكروباصة سعة 20 إلى 200 ميكرولتر ، اختر كمية صغيرة من اللقاح من كل مستعمرة تم الحصول عليها بعد تحويل مكتبة cDNA على اللوحة التي تحتوي على 4-NQO. أضف اللقاح من كل مستعمرة من المستعمرات المختلفة إلى كل بئر من الطبق يحتوي على ماء معقم واخلطه جيدا. حدد ثلاثة ميكرولترات من تعليق الخلية من كل بئر على ألواح أجار EMM2 وأضف تركيزات مناسبة من 4-NQO إلى اللوحات.

بعد نمو الخلايا عند 32 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام ، حدد المستعمرات التي تظهر نموا بتركيزات مختلفة من 4-NQO كمثبطات مفترضة. لمزيد من التحقق من صحة المثبطات ، قم بزراعة المثبطات المختارة وسلالات التحكم المناسبة في وسط EMM2 الذي يحتوي على 225 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأدينين والوراسيل عند 32 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الاهتزاز. بعد نهاية الحضانة ، قم بتخفيف الخلايا إلى كثافة بصرية تبلغ 0.3 في وسط EMM2 الطازج وقم بتنميتها أثناء اهتزازها عند 32 درجة مئوية حتى مرحلة منتصف السجل.

حدد التخفيفات التسلسلية المناسبة للمزارع على لوحات EMM2 مع المكملات الغذائية المطلوبة التي تحتوي إما على 0.4 ميكرومولار 4-NQO أو 0.01٪ MMS. للتحكم ، حدد السلالات على لوحة EMM2 مع المكملات الغذائية المطلوبة ولكن تفتقر إلى أي عامل ضار بالحمض النووي. احتضن الصفائح عند 32 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام لمراقبة النمو.

حدد السلالات المتحولة مع الجين الكامل الطول محل الاهتمام أو الناقل الفارغ كعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي ، إلى جانب محولات المكتبة. تلقيح مستعمرة خميرة واحدة في وسط EMM2 تحتوي على 225 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأدينين واليوراسيل وتنمو الخلايا عند 32 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز عند 200 إلى 250 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بحصاد 10 ملليلتر من الكثافة البصرية 0.5 عن طريق الطرد المركزي عند 4،000 مرة غرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 0.2 ملليلتر من المخزن المؤقت للتحليل. أضف 0.2 ملليلتر من كحول إيزواميل كلوروفورم الفينول و 0.3 جرام من الخرز الزجاجي المغسول بالأحماض إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. اخلطي عن طريق دوامة الأنبوب لمدة دقيقتين ، يليه احتضان على الثلج لمدة دقيقة واحدة.

جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 10،000 مرة G لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 200 ميكرولتر من كحول إيزوميل كلوروفورم الفينول. بعد الطرد المركزي مرة أخرى عند 10،000 مرة G لمدة 10 دقائق ، انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب جديد.

ثم ، أضف مجلدين من الإيثانول 100٪ وحجم 1 × 10 من خلات الصوديوم إلى الأنبوب واحتضنه عند 70 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة. عجل الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في 10،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية وإزالة supernatant. اغسل حبيبات الحمض النووي بنسبة 70٪ من الإيثانول وجففها بالهواء في درجة حرارة الغرفة.

أعد تعليق الحمض النووي في 20 ميكرولتر من الماء المعقم واستخدم ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من الحمض النووي البلازميدي لتحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة. باستخدام البروتوكول القياسي ، قم بتحويل بلازميدات الخميرة المعزولة إلى سلالة الإشريكية القولونية TOP10 ونشر الخلايا على ألواح LB بالمضادات الحيوية المطلوبة. بعد عزل البلازميد عن محولات الإشريكية القولونية باستخدام بروتوكول التحلل القلوي القياسي ، اتبع المجموعات المناسبة من إنزيمات التقييد للتحقق من إطلاق جزء الحمض النووي المدرج عن طريق تقييد الهضم.

بعد ذلك ، أعد تحويل البلازميدات التي تظهر إطلاق الإدراج بعد هضم التقييد في سلالة حذف ell1 للتحقق من قدرتها على إنقاذ النمط الظاهري الحساس للإجهاد السام الوراثي لسلالة حذف ell1. أظهرت سلالة Schizosaccharomyces pombe المحذوفة ell1 حساسية تجاه 4-NQO مقارنة بالسلالة البرية. يتم الحصول على عدد كبير من المستعمرات على اللوحة التي تفتقر إلى 4-NQO.

ومع ذلك ، تم الحصول على عدد أقل من المحولات على لوحة 4-NQO لأنها تعمل كمثبطات عقابية لحساسية 4-NQO للمتحور الفارغ ell1. من بين 620 محولا ، أظهر 74 نموا على 0.4-micromolar 4-NQO. لوحظ أن 16 فقط من أصل 74 أظهرت نموا في وجود 0.8-micromolar 4-NQO.

تحولت سلالة حذف ell1 مع متجه فارغ وأظهرت جميع المحولات ال 16 نموا على اللوحة التي تفتقر إلى 4-NQO. لم يظهر متحور حذف ell1 الذي يحتوي فقط على المتجه الفارغ أي نمو عند 0.8-micromolar 4-NQO وأظهرت ستة محولات نموا عند 0.8-micromolar 4-NQO ، مما يشير إلى أن استنساخ المكتبة الموجود فيها يمكن أن يقمع النمط الظاهري للإجهاد الوراثي للمتحور الفارغ ell1. تقييد هضم البلازميد المثبط 84 و 104 أطلق إدراج زوج واحد من قاعدة الكيلو و 800 قاعدة ، على التوالي.

أدت إعادة إدخال استنساخ البلازميد المثبط في المتحور الفارغ ell1 إلى قمع حساسية النمو المرتبطة ب 4-NQO. ومع ذلك ، في وجود MMS ، أظهرت البلازميدات المثبطة التي تحتوي على متحور حذف ell1 نموا أكبر من تلك التي تحتوي على ناقل فارغ. يمكن لهذه الشاشات الجينية تحديد آليات المقاومة المحتملة وتحديد أهداف البروتين للمركبات الجديدة المضادة للبكتيريا أو الفطريات أو المضادة للطفيليات أو المضادة للسرطان.

يمكنهم أيضا تحديد آلية عمل الأدوية الصيدلانية.