التصوير المتزامن والكشف القائم على قياس التدفق الخلوي لعلامات الشيخوخة الفلورية المتعددة في الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج
يوليو 12, 2022
نقدم هنا طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي للتصور والقياس الكمي للعلامات المتعددة المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا المفردة.
يمكن لهذه الطريقة توليد صور عالية الدقة بسرعة تسمح بتحليل التوزيع المكاني وتحديد كمية إشارات الفلورسنت داخل الخلايا مع السماح بالتحليل السريع لعينات متعددة. يتم قياس الخلايا باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي المتقدم للتصوير ، والذي يجمع بين السرعة والحساسية والصور التفصيلية أحادية الخلية مع المعلومات المكانية التي تنتج بيانات فريدة لا يمكن توفيرها بواسطة قياس بصريات التدفقات أو الفحص المجهري. إحدى النصائح المهمة هي توفير خلايا كافية لإنشاء إعدادات الأداة ونقوم بتعليق الخلايا عند الكثافة العالية للقياسات.
بصرف النظر عن هذا الحصول على البيانات هو مباشر ومشابه لقياس التدفق الخلوي التقليدي. قم أولا بإنشاء خطوط خلايا DLBCL كما هو موضح في المخطوطة. ثم أضف محلول EdU 10 ملليمولار بنسبة واحد إلى 1000 في مزرعة خلايا DLBCL واحتضن اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات بعد خلط اللوحة عن طريق الهزاز اللطيف.
أخرج الصفيحة بعد الحضانة وأضف محلول كلوروكين 100 مللي مولا إلى تركيز نهائي من 75 ميكرومولار. تخلط عن طريق الهزاز بلطف وتحضن لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 20 ملليمولار C12 FDG إلى تركيز نهائي من 20 ميكرومولار.
بعد الخلط اللطيف ، احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، أضف محلول 100 ملليمولار 2-فينيل إيثيل-بيتا-د-ثيوغالاكتوسيد في واحد إلى 50 لوقف تلطيخ بيتا غال FSA. وقم بتدوير اللوحة بلطف للخلط.
انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 ملليلتر وتدور بسرعة 100 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بمجرد التخلص من المادة الفائقة ، اغسل الخلايا بأربعة ملليلترات من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم أعد تعليق كريات الخلايا في 500 ميكرولتر عند محلول تثبيت بارافورمالديهايد بنسبة 4٪.
بعد 10 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، قم بجهاز طرد مركزي عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة واغسل الخلايا بأربعة ملليلترات من PBS مرتين وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 100 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ، تخلص من supernatant وأعد تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الصابونين.
الآن انقل التعليق إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اضرب الخلايا عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية واحتضنها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، في الظلام.
الطرد المركزي للأنابيب عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبر ناتانت واغسله ب 100 ميكرولتر من محلول غسيل الصابونين. بعد غسل الخلايا مرتين ، تخلص من supernatant وأعد تعليق كريات الخلايا في 500 ميكرولتر من كوكتيل الكشف عن EdU.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام وأجهزة الطرد المركزي في 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبر ناتانت واغسله بملليلتر واحد من محلول غسل الصابونين. كرر الغسيل مرتين ، وتخلص من supernatant وأعد تعليق كريات الخلايا في 20 إلى 50 ميكرولتر من PBS.
قبل تشغيل الجهاز ، أفرغ زجاجة سائل النفايات وتحقق من مستويات SpeedBeads والمعقم والمنظف ومزيل الفقاعات وغمد السوائل الكافية. بعد تشغيل الجهاز وبرنامج التصوير ، انقر فوق زر بدء التشغيل لتهيئة الموائع ومعايرة النظام. اضبط التكبير على 40 مرة واضبط سرعة الانسيابية على منخفضة.
بعد تشغيل الليزر ، قم بتشغيل ليزر 405 نانومتر لقياس EdU Pacific Blue ، و 488 نانومتر لقياس C12-FDG و 642 نانومتر لقياس Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. قم بتعيين القناة السادسة للقناة المبعثرة والقناة الأولى والقناة التاسعة للحقل الساطع. ثم ابدأ بالعينة المتوقع أن يكون لها أعلى تألق لإعداد شدة الليزر وقلب أنبوب العينة بلطف للخلط.
بعد فتح غطاء الأنبوب، أدخل أنبوب العينة في قفص الاتهام. انقر فوق تحميل لبدء وفتح مؤامرة مبعثرة. بعد ذلك ، حدد منطقة الميزات ، وقم بتسطير MO1 ونسبة العرض إلى الارتفاع تسطير MO1 للمحورين X و Y على التوالي.
قم بتعيين بوابة فوق نسبة العرض إلى الارتفاع تبلغ 0.5 لاستبعاد الثنائيات ومجاميع الخلايا أسفل الجانب الأيمن وعلى الجانب الأيمن ومجموعة SpeedBead على الجانب الأيسر. الآن ، افتح مخطط الرسم البياني وحدد معلم الجذر المتدرج متوسط مربع القناع واحد والقناة الأولى للمحور X. اختر المجموعة السكانية المفردة واضبط البوابة للتحديد للخلايا المركزة.
افتح مخطط الرسم البياني وحدد كثافة البكسل القصوى الخام لقناة المحور X الثانية والسابعة و11. ثم اضبط قوى الليزر لليزر 488 نانومتر و 405 نانومتر و 642 نانومتر للقناة الثانية والسابعة و 11 على التوالي بحيث يكون لكل فلوروكروم قيمة بكسل قصوى خام بين 100 و 4000 لتجنب الإفراط في التشبع. اختر المجموعة المركزة لتسجيلها وانقر فوق اكتساب لقياس عينات DLBCL بإعدادات متسقة.
عند تغيير العينات للقياس ، انقر فوق الرجوع لاستعادة أنبوب العينة. اضغط على تحميل لتجاهل العينة. بعد قياس جميع العينات ، قم بإيقاف تشغيل الليزر الساطع والتشتت.
قم بقياس عينات التحكم بلون واحد لإنشاء مصفوفة تعويض. انقر فوق إيقاف التشغيل لإغلاق نظام التصوير. تحليل البيانات في برنامج تحليل الصور.
استخدم أداة Spot Wizard الخاصة ببرنامج تحليل الصور لحساب بؤر غاما H2AX النووية وصور الخلايا الحية وقياسها كميا تلقائيا. حدد مجموعتين من الخلايا، واحدة ذات عدد نقاط مرتفع والأخرى ذات عدد نقاط منخفض لتدريب معالج البقع على مزيد من التحليل التلقائي لعدد النقاط. أظهرت طريقة قياس التدفق الخلوي في صور الخلية الواحدة زيادة إيجابية C12-FDG ، وسلبية EdU ، وإيجابية غاما H2AX ، وعدد السكان المسنين و KARPAS422.
خلايا WSU-DLCL2 و OCI-LY1 ، ولكن ليس في خلايا SU-DHL6. قدم التحليل القائم على التصوير أعدادا أعلى بكثير من بؤر غاما H2AX و KARPAS422 و WSU-DLCL2 و OCI-LY1 ، ولكن ليس في خلايا SU-DHL6. ومثلت نتائج مماثلة ببيانات التواتر والقياس الكمي.
تعد إضافة الصابونين إلى تعليق الخلية أمرا بالغ الأهمية ، وإلا فلن تتمكن الأجسام المضادة من الوصول إلى المستضدات الداخلية للخلية وتؤدي المنظفات القاسية إلى فقدان إشارة C12-FTG يعد قياس الخلايا التصويري مثاليا لتحليل التغيرات في توطين العلامات مثل نقل عامل النسخ إلى النواة استجابة لبعض المحفزات. يمكن أيضا تحقيق مثل هذا التحليل باستخدام بروتوكولنا. تسمح هذه الطريقة بتصور علامات الفلورسنت المتعددة على مستوى خلية واحدة مما يساعد على اكتشاف وجود الإشارات الفردية وكثافتها وتوطينها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي لتصوير وتقدير وجود علامات متعددة مرتبطة بالشيخوخة في خلايا مفردة. تتيح هذه الطريقة التوليد السريع للصور عالية الدقة وتحليل التوزيع المكاني وتقدير الإشارات الفلورية داخل الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- قياس التدفق الخلوي
- شيخوخة الخلية
الخلفية
- يعتبر قياس التدفق الخلوي أداة قوية لتحليل التجمعات الخلوية.
- يجمع قياس التدفق الخلوي المتقدم بين السرعة والحساسية.
- فهم العلامات المرتبطة بالشيخوخة ضروري للعديد من الدراسات البيولوجية.
- يوصى بتعليق الخلايا عالي الكثافة للحصول على إعدادات مثالية للأداة.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة لتحليل علامات الشيخوخة المتعددة في خلايا مفردة.
- تحسين دقة وسرعة الحصول على البيانات في قياس التدفق الخلوي.
- توفير بيانات فريدة لا يمكن أن تقدمها الطرق التقليدية.
الطرق المستخدمة
- استخدام نظام قياس التدفق الخلوي المتقدم.
- تحضير خطوط خلايا DLBCL كما هو موضح في المخطوطة.
- دمج محلول EdU في زراعة الخلايا.
- تحضين الخلايا في بيئة مضبوطة للحصول على نتائج مثالية.
النتائج الرئيسية
- تم التوليد بنجاح لصور عالية الدقة للخلايا.
- تم تحقيق تقدير للإشارات الفلورية بدقة.
- تم تحليل التوزيع المكاني لعلامات الشيخوخة بشكل فعال.
- أظهرت الطريقة كفاءة في معالجة عينات متعددة.
الخلاصات
- تعزز الطريقة الجديدة تحليل علامات الشيخوخة.
- تقدم تقدمًا كبيرًا مقارنة بقياس التدفق الخلوي التقليدي.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية سياقات بحث بيولوجي أوسع.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple senescence markers enables rapid, quantitative assessment of therapy-induced senescence in cancer cell populations. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence at key discovery and translational inflection points. Integrating high-content single-cell analysis into oncology pipelines enhances target validation and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of senescence pathways following chemotherapeutic intervention.
- Supports functional target validation by quantifying senescence-associated markers at the single-cell level.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing senescence from apoptosis in treated cancer cells.
- Improves predictive confidence for candidate selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed assays for high-throughput compound screening in oncology models.
- Standardizes detection of SA-β-gal, EdU, and γH2AX for reproducible, quantitative outputs.
- Enables scalable, multi-marker readouts to support robust screening workflows.
- Provides reliable data for compound efficacy and mechanistic profiling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns senescence marker detection with disease-relevant models for translational continuity.
- Supports biomarker-driven preclinical validation of therapeutic strategies targeting senescence.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative senescence profiles.
- Enhances predictive de-risking for late-stage candidate progression.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, screening, and translational research by enabling multiplexed, quantitative analysis of senescence in cancer models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for therapy-induced senescence mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative multi-marker outputs for assay readiness.
- Analytics: Provides high-resolution, single-cell measurements and spatial localization of fluorescent markers.
- Translational Research: Connects senescence marker quantification to preclinical model validation and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multiplexed senescence detection across oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence research.
- Operational Value: Standardizes multiplexed detection and streamlines high-content data acquisition.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in imaging flow cytometry and multi-marker assay development.
- Demands advanced instrumentation and robust analytical software for single-cell image analysis.
- Necessitates cross-team standardization of gating, compensation, and marker quantification protocols.
- Adaptation across diverse cancer models may require marker-specific optimization.
- Signal loss or marker accessibility can be affected by permeabilization and staining conditions.
