قياس تصلب الكبد باستخدام مجهر القوة الذرية إلى جانب مجهر الاستقطاب
يوليو 20, 2022
نقدم بروتوكولا لقياس الوحدات المرنة للمناطق الغنية بالكولاجين في الكبد الطبيعي والمريض باستخدام مجهر القوة الذرية. يوفر الاستخدام المتزامن لمجهر الاستقطاب دقة مكانية عالية لتوطين المناطق الغنية بالكولاجين في أقسام الكبد.
يوفر بروتوكولنا تمييزا بين المناطق الغنية بالكولاجين والكولاجين التي تفتقر إلى أقسام الكبد. وبالتالي يمكن استخدامه لدراسة عمليات تكوين الألياف في تفاصيل أكبر. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام الفحص المجهري المستقطب لتحديد المناطق الغنية بالكولاجين في أقسام الكبد.
يمكن أن توفر بروتوكولاتنا نظرة ثاقبة لتطور تليف الكبد ، ويمكن أيضا اعتمادها للأنسجة الرخوة الأخرى مثل الرئتين بعد تحسينات معينة. للبدء ، قم بإزالة أقسام الكبد المجمدة من 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وقم بإذابتها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ثبت المقاطع بالثلج البارد 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، تليها الغسيل خمس مرات باستخدام PBS.
بعد الغسيل الأخير ، امسح PBS الزائد حول قسم الكبد باستخدام الأنسجة ، وحدد حدا يبلغ حوالي سنتيمترين في أربعة سنتيمترات حول قسم الكبد بقلم علامة كاره للماء. قم بتغطية العينة باستخدام PBS ، ثم قم بتحميل العينة على مرحلة AFM ، وقم بتغطيتها برأس AFM. في مجهر القوة الذرية أو برنامج AFM ، انتقل إلى علامة تبويب الإعداد وحدد علامة على الحفظ التلقائي لحفظ جميع الملفات تلقائيا.
ثم حدد اسم الملف والدليل لحفظ ملفات القياس بالانتقال إلى علامة تبويب الإعداد والنقر فوق حفظ الإعدادات. اقترب من سطح الأنسجة باستخدام الكابولي AFM عن طريق تشغيل الليزر والنقر على مفتاح الاقتراب. بعد اكتمال النهج ، اسحب طرف الكابولي بالنقر فوق مفتاح التراجع مرة واحدة ، والذي يسحب الكابولي إلى الطرف العلوي من نطاق بيزو.
إذا لزم الأمر ، أعد محاذاة الكاشف باستخدام مقابض على رأس AFM. أطفئ الليزر. النصيحة هي الآن في بؤرة الهدف.
بعد ذلك ، قم بتراكب المجال البصري للمجهر باستخدام خرائط قياس AFM بالنقر فوق علامة التبويب الملحقات وتحديد المعايرة البصرية المتراكبة المباشرة. في النافذة التالية ، انقر فوق التالي لالتقاط سلسلة من الصور للناتئ الذي يقوم بمسح منطقة معينة. انقر فوق التالي مرة أخرى للانتقال إلى النافذة التالية.
في الصورة الأولى ، انقر فوق وسط طرف الكابولي يدويا لتصوير موضع الطرف في البرنامج. يمكن التلاعب بحجم الدائرة التي تصور موضع الطرف من خلال الإشارة إلى نصف قطرها لزيادة الدقة. انقر فوق معايرة لاكتشاف موضع طرف الكابولي في جميع الصور تلقائيا.
تأكد من دقة اكتشاف التلميح من خلال تصفح الصور. انقر فوق التالي، ثم قم بإنهاء لإنهاء التراكب البصري. بعد ذلك ، حرك المسرح لوضع منطقة غنية بالكولاجين داخل المربع الأخضر ، مرئية في علامة تبويب عارض البيانات ، باستخدام الصورة المستقطبة.
حدد المنطقة الغنية بالكولاجين عن طريق تحديد المنطقة الموجودة أسفل علامة تبويب الشبكة ، ثم إنشاء مستطيل في علامة تبويب عارض البيانات باستخدام الضغط لفترة طويلة على زر الماوس الأيسر داخل المربع الأخضر المحدد. انقر فوق تأكيد منطقة المسح الجديدة لتعيين المنطقة المحددة كمنطقة قياس. اضبط معلمات حلقة الملاحظات.
تعيين I كسب عند 50 هرتز وكسب P عند 0.001. ثم اضبط نقطة الضبط على نانو نيوتن واحد. حدد قيمة نقطة الضبط النسبية وفقا للخواص الميكانيكية للمواد المدروسة وصلابة الكابولي.
حدد خط أساس عادل ليلائم منحنيات القوة بشكل صحيح. ثم حدد طول حركة الكابولي في المحور Z وفقا لتضاريس سطح العينة. اضبط حركة Z على مدة ثابتة.
اضبط وقت التمديد على ثانية واحدة مع تأخير التمديد والتراجع على أنه صفر. تعيين معدل العينة في 5،000 هيرتز. ضع علامة أمام الحلقة المغلقة Z لضبط المسافة بين العينة وطرف الكابولي تلقائيا أثناء القياسات.
ثم قم بفك تعشيق التحكم الآلي في المرحلة عن طريق إلغاء تحديد زر التعشيق. قم بتشغيل الليزر واقترب من العينة باستخدام الكابولي. انقر فوق بدء المسح لجمع منحنيات مسافة القوة.
تحليل البيانات المكتسبة باستخدام برنامج AtomicJ مفتوح المصدر. قم بتحميل منحنيات القوة في البرنامج بالنقر فوق منحنيات قوة العملية وأيقونة الخرائط. ثم في مساعد المعالجة ، أضف الخرائط المراد تحليلها بالنقر فوق زر الإضافة.
بعد تحميل الخرائط ، انقر فوق التالي. حدد إعدادات المعالجة في النافذة التالية. لتقدير نقطة الاتصال بين العينة والكابولي تلقائيا باستخدام مجموعة من معلمات منحنى التركيب ، استخدم التقدير التلقائي لنقطة الاتصال.
حدد نقطة الاتصال بين الكابولي والعينة بطريقة الشبكة المركزة الكلاسيكية. حدد طريقة التقدير كطريقة مستقلة للنموذج لتحقيق أفضل تحديد لنقطة الاتصال بناء على جودة منحنيات القوة المقاسة ، والتي يجب تحديدها تجريبيا أثناء تحسين تحليل البيانات. قم بتركيب منحنى المسافة البادئة للقوة باستخدام نموذج كلاسيكي مثل L Two الكلاسيكي لملاءمة النموذج.
اضبط ملاءمة النموذج على منحنى السحب. اضبط نسبة بواسون على 0.45 على النحو الموصى به للأنسجة الرخوة مثل الكبد. اضبط ملاءمة المنحنى باستخدام درجة خط الأساس ثلاثة ودرجة التلامس الواحدة واحدة.
قم بتغيير درجة الملاءمة متعددة الحدود بناء على مقياس انحرافات المنحنيات عن النموذج. حدد النموذج المستخدم لتناسب منحنيات السحب كنموذج Sneddon. املأ نصف قطر الطرف الكروي حتى ٢٫٩ ميكرومتر.
قم بتحميل ثابت الربيع و invOLS من ملفات البيانات عن طريق تمكين القراءة ، ثم انقر فوق إنهاء. بعد تحليل البيانات ، انتقل من خلال منحنيات القوة. استبعد منحنيات القوة حيث اقترب الكابولي من سطح قسم الكبد بشكل غير صحيح.
هذه المنحنيات لها ضوضاء عالية وأشكال شاذة. بعد ذلك ، يمكن نسخ البيانات أو تصديرها. في هذه الدراسة ، تم فحص أقسام الكبد الثابتة بشكل معتدل التي تم الحصول عليها من الفئران الضابطة والفئران المصابة بالتليف الخفيف والمتقدم الناجم عن حقن رابع كلوريد الكربون باستخدام AFM.
تم تحليل المناطق القريبة من الأوردة المركزية المقابلة للمناطق التي تتشكل فيها ألياف الكولاجين في فئران رابع كلوريد الكربون عادة في الكبد الضابط. كان توزيع وحدات يونغ قابلا للتكرار عبر مناطق مختلفة في مناطق التحكم في الكبد والمناطق الغنية بالكولاجين داخل قسم كبد واحد. في الفئران المعالجة برابع كلوريد الكربون ، أظهرت خرائط الصلابة المقابلة للمناطق المحيطة بالمركز لرواسب الكولاجين قيما أعلى بكثير من وحدات يونغ مقارنة بالمناطق المكافئة في الفئران الضابطة.
علاوة على ذلك ، كانت هناك زيادة كبيرة في قيم وحدات يونغ مع علاج أطول. كما تم تقييم تأثير التخزين المطول لأقسام الكبد على الخواص الميكانيكية لألياف الكولاجين. أظهرت قياسات AFM قيما أقل بكثير من وحدات يونغ في المناطق الغنية بالكولاجين للأقسام المخزنة لمدة ثلاثة أشهر ، مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها في غضون أسبوعين.
يحدد وقت تثبيت قسم الكبد بشكل كبير الخواص الميكانيكية لقسم الكبد. نوصي بالفواصل الزمنية المنصوص عليها في البروتوكول يجب اتباعها بدقة. بعد بعض التحسينات في البروتوكول ، يمكن استخدام الطريقة المحددة لأي أنسجة رخوة تظهر ترسبا كبيرا للكولاجين ، والذي يمكن اكتشافه عن طريق الفحص المجهري المستقطب.
توفر التقنية المعطاة للباحثين بروتوكولا موحدا ومريحا لدراسة آلية الكبد عبر الصحة والمرض.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا لقياس الوحد المرنة للمناطق الغنية بالكولاجين في أنسجة الكبد الطبيعية والليفية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) بالاشتراك مع مجهر الاستقطاب. تتيح هذه التقنية دقة مكانية عالية في تحديد المناطق الغنية بالكولاجين، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم التليف الكبدي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- تليف الكبد وتوصيفه
- الخصائص المرنة للأنسجة
- تطبيق تقنيات التصوير المتقدمة
الخلفية
- الحاجة إلى تحسين الطرق لتمييز المناطق الغنية بالكولاجين عن المناطق التي تفتقر إلى الكولاجين في أنسجة الكبد.
- فهم التليف حيوي لأبحاث أمراض الكبد.
- يوفر مجهر القوة الذرية (AFM) قياسات عالية الدقة في الأنسجة الرخوة.
الطرق المستخدمة
- مجهر القوة الذرية (AFM) لقياس الوحد المرنة
- مناطق غنية بالكولاجين في أنسجة الكبد كنظام بيولوجي
- مجهر الاستقطاب لتحديد موقع الكولاجين
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح للمناطق الغنية بالكولاجين في أقسام الكبد
- قياس وحد يونغ عبر مناطق الكبد المختلفة
- مدخل حول الخصائص الميكانيكية المرتبطة بالتليف
الاستنتاجات
- يُظهر البروتوكول نهجًا موثوقًا لدراسة تليف الكبد.
- يمكن تعديل هذه الطريقة بشكل محتمل للأنسجة الرخوة الأخرى، مما يسهم في أبحاث بيولوجية أوسع.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of liver stiffness at the cellular level is critical for de-risking early-stage fibrosis targets and understanding disease progression mechanisms. Atomic force microscopy (AFM) coupled with polarization microscopy enables precise mapping of collagen-rich fibrotic regions, supporting predictive confidence in target validation and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by providing reproducible, spatially resolved mechanical data relevant to fibrogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of fibrogenesis by distinguishing collagen-rich from collagen-lacking regions.
- Supports biological de-risking through direct measurement of tissue mechanical properties linked to disease state.
- Provides reproducible quantitative data to inform target selection and triage in fibrosis research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue models for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative Young's modulus outputs for assay reproducibility.
- Enables high spatial precision in identifying regions of interest for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical measurements with disease-relevant tissue changes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping fibrosis progression.
- Provides predictive de-risking for therapeutic hypotheses targeting matrix remodeling.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, quantitative readouts, and cross-model standardization in fibrosis research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on matrix stiffening and its cellular effects in fibrogenesis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative stiffness measurements for assay development.
- Analytics: Generates spatially resolved Young's modulus data for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Links mechanical properties to disease progression for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for other soft tissues with collagen deposition, supporting broader R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in fibrosis target validation.
- Operational Value: Standardizes measurement of tissue mechanics with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in fibrosis programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of fibrosis and matrix-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and tissue preparation for reproducible results.
- Needs access to AFM instrumentation and polarization microscopy for spatial targeting.
- Demands strict adherence to fixation and storage protocols to ensure data integrity.
- Cross-team standardization is essential for reproducibility across studies and sites.
- Protocol adaptation may be needed for other soft tissues with distinct collagen architectures.
