تلطيخ ثلاثي الأبعاد للكلى بالكامل مع CUBIC
يوليو 18, 2022
يصف البروتوكول الحالي طريقة إزالة الأنسجة وتلطيخ الفلورسنت المناعي بالكامل لتصوير الكلى ثلاثي الأبعاد (3D). يمكن أن تقدم هذه التقنية وجهات نظر عيانية في أمراض الكلى ، مما يؤدي إلى اكتشافات بيولوجية جديدة.
يسمح هذا البروتوكول بتصور الهياكل ثلاثية الأبعاد في الكلى الكاملة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى اكتشافات مبتكرة في أبحاث الكلى من خلال توفير منظور عياني. يعد تلطيخ الأعضاء بالكامل أمرا صعبا بسبب صعوبة اختراق الأجسام المضادة. أظهر هذا البروتوكول تلطيخ الكلى بالكامل بالأجسام المضادة.
للبدء ، قم بإجراء تثبيت الغمر مباشرة بعد تثبيت التروية وأخذ عينات الكلى ، عن طريق غمر الكلى في 4٪ بارافورمالدهيد عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. أعط ثلاث غسلات باستخدام PBS لمدة ساعتين لكل منهما. قم بإجراء عملية إزالة اللون وإزالة الدهون عن طريق غمر الكلى الثابتة في سبعة ملليمترات من 50٪ CUBIC-L في أنبوب دائري القاع سعة 14 ملليلتر ، مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
بعد ست ساعات ، اغمر الكلى في سبعة ملليلتر من CUBIC-L في أنبوب دائري القاع 14 ملم ، مع اهتزاز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. قم بتحديث CUBIC-L كل يوم. بمجرد اكتمال إزالة اللون وإزالة الدهون ، استخدم ملعقة توزيع للتعامل مع العينات واغسل الكلى ثلاث مرات باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
Immunostain الكلى delipidated في الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول عازلة تلطيخ ، مع اهتزاز لطيف في شاكر حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام. بعد ذلك ، اغسل الكلى باستخدام 0.5٪ Triton X-100 في PBS ، المعروف أيضا باسم PBST ، في درجة حرارة الغرفة ليوم واحد. بالنسبة لتلطيخ الأجسام المضادة الثانوية ، عالج الكلى بأجسام مضادة ثانوية في المخزن المؤقت للتلطيخ ، في الظلام ، مع اهتزاز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام.
إصلاح تلطيخ مع غسل PBST في درجة حرارة الغرفة ليوم واحد. بعد التثبيت ، اغمر الكلى في 1٪ فورمالديهايد في PB لمدة ثلاث ساعات ، واغسلها باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات. قم بإجراء مطابقة معامل الانكسار عن طريق غمر الكلى في سبعة ملليلتر من 50٪ CUBIC-R + في أنبوب دائري القاع سعة 14 ملليلتر مع الاهتزاز لمدة يوم واحد ، يليه العلاج بسبعة ملليلتر من CUBIC-R + مع الاهتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
بمساعدة طريقة تلطيخ المناعة ، تم تصور الأعصاب والشرايين المتعاطفة في الكلى بأكملها في تصوير الكلى 3D. علاوة على ذلك ، تم تصوير الأعصاب الكلوية المتعاطفة غير الطبيعية بعد إصابة نقص التروية. سهل هذا البروتوكول أيضا تصور الأعصاب الودية في الطحال بأكمله.
يتم عرض عملية القياس الكمي للبيانات للتلطيخ المناعي ثلاثي الأبعاد هنا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصور قنوات التجميع ، والجزء S1 من الأنابيب القريبة ، والكبيبات بنجاح في كلية كاملة. كما تم تصور تضخم الكبيبات المكبوت ، الناتج عن إعطاء الدواء في المراحل المبكرة من مرض الكلى السكري ، في التصوير 3D.
يمكن لهذا البروتوكول تسمية جزيء معين داخل كلية بأكملها. وبالتالي ، يمكن للباحثين تحليل تغيير البنية في الأوعية الدموية أو العثور على أحداث نادرة في أنسجة الكلى.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يتيح هذا البروتوكول تصور البنى ثلاثية الأبعاد في الكلية الكاملة، مما يوفر منظوراً عيانياً يمكن أن يؤدي إلى اكتشافات مبتكرة في أبحاث الكلى. تتضمن الطريقة شفافية الأنسجة والصبغ المناعي الفلوري للعينات الكاملة لتحسين جودة التصوير.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- علم الأمراض
خلفية علمية
- يُعد صبغ الأعضاء بالكامل عملية صعبة نظراً للصعوبات التي تواجه تغلغل الأجسام المضادة.
- يعد الصبغ عالي الجودة أمراً حاسماً للتصوير ثلاثي الأبعاد الدقيق.
- يعالج هذا البروتوكول المشكلات الشائعة في تصوير الكلى.
- يمكن أن تؤدي المنظورات العيانية إلى رؤى بيولوجية جديدة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة للتصوير ثلاثي الأبعاد للكلى.
- تحسين تصور بنى الكلى.
- تسهيل الاكتشافات المبتكرة في علم أمراض الكلى.
الطرق المستخدمة
- التثبيت بالغمر في 4% paraformaldehyde عند 4°C لمدة 16 ساعة.
- الغسل باستخدام PBS ثلاث مرات، ولمدة ساعتين في كل مرة.
- إزالة اللون وإزالة الدهون باستخدام 50% CUBIC-L.
- الرج اللطيف في درجة حرارة الغرفة أثناء عملية إزالة الدهون.
النتائج الرئيسية
- توضيح صبغ عالي الجودة للكلى بكامل حجمها.
- تحقيق تغلغل محسن للأجسام المضادة.
- توفير تصور ثلاثي الأبعاد واضح لبنيات الكلى.
- تمكين رؤى عيانية لتحسين فهم باثولوجيا الكلى.
الاستنتاجات
- يؤدي هذا البروتوكول بنجاح إلى تحسين تقنيات تصوير الكلى.
- يفتح هذا البروتوكول آفاقاً لاكتشافات جديدة في أبحاث الكلى.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاعتماد على هذه الطريقة لتحقيق رؤى إضافية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التلوين ثلاثي الأبعاد للكلى الكاملة باستخدام تقنية CUBIC تصوراً شاملاً للبنى المجهرية الكلوية، مما يتجاوز قيود علم الأمراض التقليدي. وتدعم هذه القدرة رسم خرائط عالية الدقة للأوعية الدموية، والأنيبيبات، والكبيبات، والأعصاب الودية، مما يوفر رؤى بالغة الأهمية للاكتشاف المبكر وتقليل المخاطر الميكانيكية في أبحاث أمراض الكلى. كما تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية عند نقاط التحول الرئيسية في تطوير المحافظ الدوائية قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يسمح باستقصاء البنية الكلوية والشبكات الخلوية بدقة الخلية الواحدة.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال تصور التغيرات الهيكلية بعد الإصابة أو التدخل العلاجي.
- يسهل التحقق من الأهداف الوظيفية عبر رسم خرائط شامل للأعصاب السمبثاوية والكبيبات الكلوية.
- يعزز الثقة التنبؤية لتحديد أولويات أهداف علاج أمراض الكلى.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز أنظمة بيولوجية ثلاثية الأبعاد مُصادق عليها لسير عمل التصوير والقياس الكمي اللاحق.
- يوحد عملية صبغ الأعضاء الكاملة للحصول على مخرجات كمية قابلة للتكرار عبر الدراسات المختلفة.
- يتيح التصوير القابل للتوسع للأحداث النادرة والتغيرات الهيكلية في أنسجة الكلى.
- يدعم التقييم الموثوق لتأثيرات المركبات على التشريح المجهري الكلوي.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط مخرجات التصوير ثلاثي الأبعاد بمؤشرات حيوية ذات صلة بالمرض مثل glomerulomegaly.
- يوفر الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال تصور آثار التدخل.
- يتيح اتخاذ قرارات تقدم مدروسة بناءً على تقييم المخاطر وتحليل شامل للأنسجة.
- يقدم تقليلاً تنبؤياً للمخاطر في برامج أبحاث الكلى الانتقالية.
تكامل تدفق العمل والعمليات المتسلسلة
يتكامل بروتوكول الصبغ ثلاثي الأبعاد للكلية الكاملة هذا مع سلسلة العمل الممتدة من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، مما يدعم اختبار الفرضيات، والتحقق من صحة الأهداف، ومواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية في أبحاث الكلى.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال رسم خرائط للهياكل الكلوية واستجابات الإصابة.
- الفحص: توفر مخرجات تصوير ثلاثية الأبعاد قابلة للتكرار وجاهزة للمقايسة لإجراء مقارنة كمية للظروف التجريبية.
- التحليلات: تتيح قياس وتقدير التغيرات الهيكلية كمياً، مما يدعم التحليل الإحصائي القوي.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج التصوير بنماذج الأمراض وتحديد المؤشرات الحيوية المبكرة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتصوير العضو كاملاً عبر دراسات الكلى والأنسجة ذات الصلة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الأهداف الكلوية.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل للتصوير ثلاثي الأبعاد (3D) يتسم بالمعيارية والقابلية للتوسع والتكرار.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال تمكين التحليل الشامل للأنسجة.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض ببرامج أمراض الكلى.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في شفافية الأنسجة، والصبغ المناعي، وتحليل التصوير ثلاثي الأبعاد.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة تصوير متقدمة وأدوات تحليل حاسوبية.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لضمان قابلية التكرار ومقارنة البيانات.
- قد يتطلب التكييف ليتناسب مع أنظمة أعضاء مختلفة أو مجموعات أجسام مضادة متنوعة.
- يمثل نفاذ الأجسام المضادة ومدة الصبغ قيوداً عملية عند تصوير العضو كاملاً.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
