توصيف البروتين عبر الغشاء الحويصلة خارج الخلية بواسطة قياس التدفق الخلوي النانوي

يمكن أن يكون التوصيف المتعمق للمركبات الكهربائية تحديا ، مما يتطلب أدوات متعددة لوصف المعلمات الفردية. إن قياس هذه المعايير الرئيسية في تقنية واحدة مثل قياس التدفق الخلوي النانوي يصف مجموعات فرعية متعددة من المركبات الكهربائية في وقت واحد. لذلك يتم قياس كل EV بشكل فردي لتحديد الجسيمات التي يزيد قطرها عن 14 نانومتر خالية من الملصقات قبل تحديد تألقها.

هذا يجعل مجموعة بيانات قوية عن طريق إزالة الإيجابيات الخاطئة. يمكن تطبيق قياس التدفق الخلوي النانوي على المركبات الكهربائية من مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك تلك المخصبة من البلازما ، CSF ، ووسط الثقافة. تستخدم هذه التقنية أيضا لتحليل الفيروسات والجسيمات النانوية الدهنية والمواد النانوية.

من المهم تحسين بروتوكول وضع العلامات. هذا يزيد من أي تألق مرتبط بجسيم مقارنة بأي تألق متبقي في المخزن المؤقت. للبدء، قم بتشغيل الجهاز، وقم بتحميل Nano-Flow Profession وحدد بدء التشغيل من القائمة المنسدلة Sheath Flow، وقم بتحميل الماء في حاوية التحميل، وحدد التعزيز من القائمة المنسدلة Sheath Flow.

قم بتخفيف حبات مراقبة الجودة من واحد إلى 100 في الماء المقطر في أنبوب سعة 0.6 ميكرولتر ، وضعها في حجرة التحميل لإدخال العينة في النظام. ثم قم بتعزيز العينة لمدة 45 ثانية كما هو موضح سابقا لاستبدال العينة السابقة أو الماء أو محلول التنظيف السابق. أثناء التعزيز ، اضبط طاقة الليزر على القالب المحدد مسبقا لخرز مراقبة الجودة على معيار 250 نانومتر FL QC.

في وقت لاحق، لتقليل ضغط النظام، حدد ضغط أخذ العينات من نفس القائمة المنسدلة واضبط ضغط أخذ العينات التلقائي على باسكال كيلو واحد للحفاظ على ضغط ثابت. ثم ابدأ التحليل لمدة دقيقة واحدة عن طريق تحديد وقت التسجيل من عناصر التحكم في الاستحواذ. سيتم رسم البيانات على مخطط النقاط الذي يوضح مقياس سجل لشدة التشتت الجانبي ، وكثافة التألق المحددة.

قبل حفظ الملف، أدخل اسم الملف وتخفيف العينة. بعد ذلك ، حدد إلغاء التحميل لإزالة الأنبوب من حاوية التحميل. استبدل حبات مراقبة الجودة ب 150 ميكرولتر من محلول التنظيف ونظفها لأكثر من 30 ثانية عن طريق تحديد تعزيز.

باستخدام أنبوب يحتوي على 150 ميكرولتر من الماء ، قم بإزالة أي محلول تنظيف زائد من الطرف الشعري عن طريق غمس الطرف في الماء. ثم قم بتخفيف حجم الخرز القياسي من واحد إلى 100 في الماء وقم بتحميل 100 ميكرولتر في خليج التحميل. الآن ، اضبط طاقة الليزر على القالب المحدد مسبقا ، S16 EXO 68 إلى 155 نانومتر.

هذا الإعداد مخصص لكل من معيار الحجم والعينات التي تحتوي على مركبات كهربائية أصغر من 200 نانومتر. حدد أخذ العينات وتابع تسجيل العينة لمدة دقيقة واحدة. قم بإجراء القياس الثالث باستخدام عينة ماء أو PBS لإنشاء قياس فارغ يقلل من القيمة ، مع تحديد الإيجابيات الخاطئة لإزالتها بواسطة البرنامج.

قم بتخفيف عينات EV غير المصنفة في PBS إلى نطاق تركيز جسيمات مناسب من 10 إلى الثامن إلى خمسة أضعاف 10 إلى الجسيمات الثامنة لكل ملليلتر لتحليل nFCM. وتحميل 10 إلى 100 ميكرولتر من العينة المخففة في خليج التحميل. إذا كان تركيز الجسيمات غير معروف، فابدأ بتخفيف واحد إلى 100 لعينة EV.

يمكن تقريب تركيز العينة بسرعة من خلال حجم بقعة الليزر على كاميرا CCD أثناء التعزيز ، أو عن طريق مراقبة تتبع انفجار الحدث أثناء أخذ العينات. بمجرد تعزيز العينة المحملة لمدة 45 ثانية، سجل لمدة دقيقة واحدة واحفظ الملف كما هو موضح سابقا. بعد التسجيل ، ابدأ في تحليل هذه البيانات ، والتبديل من علامة التبويب الاستحواذ إلى علامة التبويب تحليل وفتح ملفات NFA المحفوظة.

للحصول على قياس دقيق للعينة، استخدم القياسين القياسيين المأخوذين قبل قياس العينات لتعيين قيم لمقارنة العينات بالإضافة إلى الفارغة. قم بإنشاء منحنى قياسي للحجم لتحويل التشتت الجانبي إلى قطر عن طريق تحديد حجم الملف القياسي واستخدام أداة عتبة التعيين. وتحدد العتبة، المرئية في تتبع انفجار الحدث، الحد الأدنى لشدة الإشارة المطلوبة لاعتبار الحدث ذا أهمية.

باستخدام مجموعة العتبات، تحقق من معلمات مخطط النقاط، SS-H أو SS-A على المحور X، وFITC-A على المحور Y. افتح أداة توليد المنحنى القياسي وحدد S16 EXO 68 إلى 155 نانومتر كقالب التحجيم. انقر فوق Find Peaks لتحديد شدة تشتت جانب الذروة إما على أنها جسيمات قطرها 68 أو 91 أو 113 أو 155 نانومتر.

قبل إغلاق النافذة، تحقق مما إذا كان الجانب المتناثر إلى منحنى القطر قد تم إنشاؤه بقيمة R قريبة من واحد. اضبط معيار التركيز. حدد الملف المحفوظ ، وانقر فوق معيار العد وأدخل تركيز الجسيمات للمعيار.

قم بتعيين المعلومات القياسية. حدد ملف نموذج EV واضبط العتبة. حدد الملف الفارغ وانقر فوق تعيين فارغ لتحديد عدد الإيجابيات الخاطئة للإزالة من عدد العينات.

بمجرد فتح أداة إنشاء PDF ، تحقق من حجم العينة وتركيزها وتخفيفها. ثم أظهر تركيز العينة وتوزيع حجم الجسيمات. بعد وضع علامات على عينات EV كما هو موضح في المخطوطة ، خذ ميكرولتر واحد من العينة المصنفة وقم بتخفيف واحد إلى 50 في PBS في أنبوب 0.6 ملليلتر.

قم بتحميل العينة في حجرة التحميل وقم بتطبيق ضغط معزز لمدة 45 ثانية. تأكد أيضا من إعدادات الليزر الصحيحة وتحميل العدسات المناسبة. الآن ، قم بالتبديل إلى ضغط أخذ العينات وحدد وقت التسجيل.

بعد الحصول على دقيقة واحدة، قم بتسمية ملف البيانات وحفظه. قم بتفريغ العينة واستبدلها بمحلول تنظيف وعزز محلول التنظيف لأكثر من 30 ثانية قبل تحميل العينة التالية كما هو موضح سابقا. بالنسبة لتوليد PDF، قم بتطبيق نفس المعايير كما هو موضح سابقا.

سيتم تعيين القياس الفارغ فقط بشكل مختلف. حدد نموذج الملف واضبط العتبة. حدد أداة البوابة واستخدم النقرة اليسرى لرسم خط يفصل بين السكان الإيجابيين للتألق.

اضبط الأسماء والألوان للتمثيل. اضبط الملف الفارغ وانقر على تعيين فارغ لتحديد عدد الإيجابيات الخاطئة لإزالتها من كل مجموعة سكانية مختلفة. افتح أداة إنشاء PDF وحدد توزيع الحجم والتركيز والنسبة المئوية للسكان الفرعيين الإيجابيين للتألق.

على مخطط النقطة، قم بتغيير المحور Y لإظهار قياسات التألق من القناة الخضراء أو الحمراء. اضبط الفراغ وقم بإنشاء PDF كما هو موضح سابقا. على مخطط النقطة، اضبط المحور X على FITC والمحور Y على APC.

استخدم الأداة الرباعية لتحديد المجموعات الإيجابية المزدوجة للفلورسنت. اضبط الأسماء والألوان لتكون تمثيلية، ثم افتح ملف PDF وحدد المجموعات الفرعية الفلورية. أظهرت المركبات الكهربائية المشتقة من C2C12 ما يقرب من 50٪ CD9 ، و 30٪ CD63 ، و 70٪ من السكان قدموا واحدا على الأقل من علامات EV الثلاثة.

وأظهرت ملامح الحجم للمجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية المفردة التي تحمل علامة تتراسبانين أن متوسط الحجم يتراوح بين 75 و 85 نانومتر تقريبا وأقل من 65 نانومتر من المركبات الكهربائية مقارنة بإجمالي عدد الجسيمات. أظهرت المركبات الكهربائية المشتقة من SW620 حوالي 40٪ CD9 ، و 7٪ CD63 ، و 42٪ من الجسيمات على أنها تحتوي على واحد على الأقل من العلامات الثلاثة. أظهرت المركبات الكهربائية المشتقة من SW620 والتي تحمل علامة tetraspanin توزيعا طبيعيا أكثر وقطرا متوسطا أكبر يتراوح بين 90 إلى 110 نانومتر مع توزيعات مماثلة بين المجموعات الفرعية الإيجابية الفردية من tetraspanin.

أظهر وضع العلامات الغشائية مرارا وتكرارا إيجابية بنسبة 80٪ من المركبات الكهربائية المشتقة من C2C12 و SW620. ارتبطت شدة التشتت الجانبي بكثافة FITC على مخططات النقاط لكل من C2C12 و SW620. النسب المئوية الإيجابية المزدوجة تشبه إلى حد كبير النسب المئوية الإيجابية للرباعي.

ويبدو أن وضع العلامات CD63 يظهر أضعف ارتباط بوضع العلامات على الغشاء. كانت قياسات الإيجابية المئوية متشابهة بين وضع العلامات على الأجسام المضادة مع وبدون وسم غشاء إضافي. اقترح متوسط كثافة التألق لمجموعات الفلورسنت من المركبات الكهربائية المشتقة من C2C12 عرضا أقل ل CD63 و CD81 مقارنة ب CD9 EVs ، في حين أظهر SW620 أن استخدام جميع الأجسام المضادة الثلاثة يوفر إشارة تألق أكبر من أي ملصق فردي للأجسام المضادة في هذا البروتوكول ، تم تصنيف علامات EV الشائعة بشكل فلوري ، ولكن يمكن اختيار العديد من أهداف الأجسام المضادة لإظهار أصل EV ، وظيفة EV ، أو حالة المرض.