الزرع المجهري للأغشية المشبكية لإعادة تنشيط المستقبلات المشبكية البشرية للدراسات الوظيفية

تنتج اضطرابات الصحة العصبية التنكسية والعقلية عن التغيرات في التواصل المشبكي. الأحداث متعددة العوامل تغير المستقبلات المشبكية بطرق لا نفهمها تماما. يوفر الزرع المجهري للأغشية المشبكية نظرة ثاقبة على هذه التعديلات.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي إمكانية تسجيل نشاط مستقبلات الدماغ الأصلية التي تعمل في الدماغ البشري ، وبالتالي ، تمثل الأمراض التي ندرسها. المستقبلات المشبكية هي أهداف رئيسية للطب الذي ينظم النشاط الكهربائي للدماغ ، ولكن فهم كيفية تغير هذه المستقبلات ، يمكن تطوير علاجات أفضل لاستعادة وظائفها. تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح على أنواع مختلفة ، من الحشرات والأسماك والثدييات ، ولكن يمكن تطبيقها أيضا على مستقبلات الغشاء خارج الدماغ ، على سبيل المثال ، العضلات والأورام.

الاحتمالات واسعة. تشذيب إبر الحقن أمر صعب. صغيرة جدا يمكن أن تمنع حقن البروتين ، واثنين كبيرين يمكن أن تقتل الخلية.

فهو يساعد على استخدام قياس متسق ، مثل حافة شفرة الحلاقة. ابدأ بصوتنة العينات المختارة المحضرة من منطقة الدماغ البشري ذات الأهمية ثلاث مرات في الحمام مع الجليد الرطب العائم. استخدم خمس دورات ثانية في كل مرة ، وانتظر لمدة دقيقة واحدة على الثلج الرطب بين الدورات.

ضع ميكرولتر واحد من العينة على اللدائن الحرارية ، وقم بعمل مسافة بادئة على السطح ، إذا لزم الأمر ، قبل وضع العينة لمنع حركة العينة. استخدم مقابض المتلاعب الذي يحمل الحاقن النانوي لوضع الإبرة ، وحركها نحو العينة المراد ملؤها. بمجرد أن يكون طرف الإبرة في العينة ، اضغط مع الاستمرار على زر التعبئة حتى يتم أخذ عينة كافية.

مطلوب حوالي 0.5 ميكرولتر عينة ل 10 بويضات. استخدم المقابض لنقل إبرة الحاقن النانوي مرة أخرى إلى أعلى موضع. اخترق البويضة أسفل السطح مباشرة بإبرة ، وليس أعمق ، واستخدم دواسة القدم لحقن العينة.

انتظر لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان. بعد الحقن الناجح ، سوف تتوسع الخلية. استخدم المقابض الموجودة على المتلاعب للخروج من الخلية.

حرك طبق بتري بحيث يتم محاذاة البويضة التالية مع الإبرة. كرر العملية حتى يتم حقن العدد المطلوب من البويضات في الطبق ، ثم اسحب الحاقن النانوي إلى موضعه الأصلي وأزل الإبرة. تأكد من ترك بئر واحد من البويضات دون حقن لاستخدامها كعنصر تحكم.

قم بتشغيل جميع المعدات المستخدمة لتسجيل التيارات الأيونية ، ثم قم بتشغيل كمبيوتر سطح المكتب ، وقم بتسجيل الدخول إلى الإصدار 3.9.1 من WinEDR. تأكد من تشغيل البرنامج، وتعيين السجل إلى قرص. بعد ذلك ، قم بتعيين مدة التسجيل ، وقم بمسح خيار المحاكاة.

بالنسبة لقسم قطب الجهد الكهربائي ، قم بإيقاف تشغيل تعويض السعة السلبية. اضبط مفتاح محدد الكسب على 10 لقسم قطب الحمام، ثم اضبط مفتاح التبديل ثلاثي المراكز، الذي يحدد مضاعف الكسب، على x1. ستشير مصابيح LED إلى اختيار مضاعف الكسب.

قم بإيقاف تشغيل محدد وضع المشبك ، ووضع التحكم في كسب التيار المستمر ، وتعيين عنصر التحكم في الكسب على حوالي نصف الحلقة المفتوحة لعرض النطاق الترددي الكامل. اضبط الأوامر على 40 مللي فولت، وعناصر التحكم في الضغط على قيد البيانات إلى سالبة، ومضاعف المقياس إلى x2. بالنسبة للقطب الحالي ، استخدم إزاحة VE لإنشاء مرجع صفري ، قبل أن تضغط على البويضة.

بعد ذلك ، افتح برنامج WinEDR الإصدار 3.9.1 ، وانتقل إلى القائمة العلوية ، وحدد ملف ، متبوعا بجديد. قم بإنشاء المجلد الخاص بك واحفظ الملف. في القائمة الرئيسية، حدد تسجيل، متبوعا بتسجيل على قرص.

ضع جسور الأجار في الثقوب الدائرية المعنية خلف غرفة التسجيل ، وربط الآبار للأقطاب الكهربائية المستخدمة كمرجع أرضي في غرفة التسجيل. أضف حل عمل 1x Ringer إلى صمام التروية المقابل. افتح الصمام حتى تمتلئ غرفة التسجيل بمحلول رينجر.

باستخدام المتلاعبين اليمنى واليسرى التي تحمل الأقطاب الكهربائية ، قم بتوجيه إبر القطب الكهربائي إلى غرفة التسجيل المليئة بمحلول Ringer. تحقق من مقاومة كل قطب كهربائي عن طريق تصفير مقابض إزاحة VM و VE ، ثم الضغط على أزرار اختبار القطب الكهربائي. يجب أن تكون المقاومة بين 0.5 إلى ثلاثة ميجا أوم.

إذا كانت المقاومة خارج النطاق ، فاستبدلها باستخدام أقطاب كهربائية دقيقة جديدة. بعد ذلك ، املأ غرفة التسجيل بحل Ringer's Solution الطازج. استخدم ماصة زجاجية لوضع بويضة غير محقونة أو مزروعة في وسط غرفة التسجيل.

تأكد من أن البويضة مرئية بوضوح تحت المجهر مع الجانب الحيواني لأعلى. قم بتوجيه القطب الكهربائي إلى محلول Ringer حتى يلمس غشاء البويضة. اخترق الغشاء البويضي بلطف على الجانب الحيواني مع كل من الأقطاب الكهربائية ، وسجل إمكانات الغشاء المريح.

قم بتشغيل تدفق حل Ringer. باستخدام مضخم Oocyte Clamp ، قم بتغيير الوضع إلى مشبك الجهد ببطء ، واضبط الجهد القابض على 80 مللي فولت. يجب أن يكون التيار الموجود على الشاشة سلبيا ، وعادة ما يتراوح بين 0 و 0.4 ميكروأمبير.

انتقل إلى ملف، جديد، ثم احفظ التسجيل على البرنامج لإنشاء ملف جديد، واحفظ التسجيل. اضغط على Record متبوعا ب Record to Disc لبدء التسجيل. أضف معلومات ذات صلة إلى الملف باستخدام مربع الحوار وضع علامة على المخطط.

ضع المنبهات للتحفيز الكيميائي عن طريق فتح الصمامات ، ودمجها في غرفة التسجيل لمدة 15 ثانية. بمجرد اكتمال التسجيل ، قم بتشغيل مشبك الجهد إلى وضع إيقاف التشغيل ، وقم بإيقاف تشغيل صمام حل Ringer. قم بإزالة البويضة ، وتخلص من اتباع السياسة المؤسسية لعينات الدماغ البشري ، ثم أوقف التسجيل واحفظ الملف.

احفظ نسخة من التسجيلات على محرك أقراص USB. من هناك ، افتح الملف المطلوب لتحليله. لقياس الاستجابة القصوى ل AMPA ، واستجابة ذروة GABA A ، أولا ، قم بإنشاء مستوى 0 أو خط أساس عن طريق العثور على الخط الأحمر ، ثم اسحبه إلى التيار الذي تم إنشاؤه بواسطة تطبيق Ringer أو خط الأساس.

بمجرد إنشاء المستوى 0، حدد قياسات الاستجابة عن طريق سحب مؤشر القراءة الرأسي الأخضر إلى الجزء المطلوب من مقتفي الرسم البياني. تم تسجيل التيارات الأيونية من البويضات التي تم حقنها مع الأغشية من المستقبلات المشبكية البشرية. تم تنشيط مستقبلات AMPA مع 100 ميكرومولار كاينات ، ومستقبلات GABA A مع واحد ملليمولار GABA.

الحقن المشترك للأغشية المصفاة من العضو الكهربائي للطوربيد ، الغني بمستقبلات الأسيتيل كولين ، وترميز cDNA لمستقبل الصف GABA واحد في القطب الحيواني أنتجت بشكل رئيسي مجموعتين من البويضات ، بناء على استجاباتها. كان لدى مجموعة واحدة من البويضات استجابات كبيرة للأسيتيل كولين ، ولكن لم تكن هناك استجابات ل GABA ميكرومولار واحد. كان للبويضات في مجموعة أخرى استجابات فارغة أو منخفضة للأسيتيل كولين ، ولكن استجابات كبيرة ل GABA.

توضح الصورة الرسومية المتوسط زائد ناقص الخطأ المعياري لمتوسط ذروة التيار في المجموعة الأولى والمجموعة الثانية. كان لدى بويضة واحدة في المجموعة الثانية استجابات كبيرة ل GABA والأسيتيل كولين ، مما يشير إلى تمزق النواة. ونتيجة لذلك، انحرف توزيع الاستجابات إلى قيم منخفضة، كما لوحظ من الفرق بين المتوسط والوسط لتوزيع تيار الغشاء.

أحد أسباب البويضات منخفضة الاستجابة هو أن الأغشية يتم حقنها ، ومحاصرتها في نواة البويضة. يتم عرض استجابات GABA و kainate للبويضات التي يتم حقنها في الأقطاب الحيوانية أو النباتية ذات الأغشية غير المصفاة التي تم الحصول عليها من دماغ غير AD ، ودماغ AD هنا. أعطت البويضات التي تم حقنها بالقرب من القطب الحيواني دون استهداف النواة استجابات أكبر من البويضات التي تم حقنها في القطب النباتي ، مما سمح بدراسة عينات الأنسجة بأعداد منخفضة جدا من المستقبلات.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، راقب دائما مستوى Ringer لديك. دائما أثناء التسجيلات المهمة ستنفد ، وبعد ذلك ستستخدم نتيجتك ، وموت البويضة ، وفقدان بيانات قيمة للغاية. بعد هذا الإجراء ، يمكننا إجراء الأحمال الغربية للتحقق من وجود المستقبلات المشبكية ، أو البروتينات ذات الاهتمام.

يسمح بقياس الإثارة العالمية لتثبيط نسب التشابك العصبي في مناطق الدماغ المختلفة ، واضطرابات الدماغ المختلفة ، مما يسمح بإجراء اختبار مباشر على التنبؤ النظري حول أسباب المرض.