قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم بالمللي ثانية لدراسة الديناميات الهيكلية ألفا سينوكلين في ظل الظروف الفسيولوجية

جميع الكائنات الحية لديها اضطراب في البروتيوم ، يقدر ما يصل إلى 33 ٪ يمكن ملاحظة هذه المناطق عن طريق قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم ، ولكن فقط في النطاق الزمني للميلي ثانية. سيوضح لك بروتوكولنا كيفية القيام بذلك بنجاح. هذه تقنية تحليلية مؤتمتة بالكامل.

ما عليك سوى إعداد كل شيء ، وبرمجة قياسات الوقت المطلوبة ، وضرب الذهاب والمشي بعيدا. تفتح هذه التقنية فرصة مثيرة لفحص المركبات التي تثبت تأكيدات محددة للبروتينات المضطربة جوهريا مثل ألفا سينوكلين. لبدء إعداد العينة لرسم خرائط الببتيد ، خذ أولا قارورة من مخزون بروتين ألفا سينوكلين المخزن من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.

وبمجرد إذابته ، قم بالتصفية باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. ثم قم بقياس امتصاص المحلول عند 218 نانومتر لتحديد تركيز البروتين باستخدام قانون بير لامبرت ، وقم بتخفيف البروتين باستخدام مخزن مؤقت للتوازن إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار. بعد ذلك ، لإعداد روبوت أخذ العينات التلقائي ، أضف 50 ميكرولتر من محلول البروتين المولي الدقيق الخمسة إلى قارورة استرداد كاملة ، وضع القارورة في موضع العينة في الغرفة اليمنى لتبادل الهيدروجين / الديوتيريوم ، أو HDX ، الروبوتات بما يتماشى مع مطياف الكتلة.

ثم ضع قارورة واحدة من المخزن المؤقت للتوازن وقريورتين من المخزن المؤقت لغسل البيبسين إلى مواضع الكاشف واحد وأربعة وخمسة من الغرف اليسرى وقارورة واحدة من المخزن المؤقت للتبريد لوضع كاشف واحد في الغرفة اليمنى HDX وضبط درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية باستخدام وحدة التحكم في درجة حرارة بلتييه. ثم أضف عددا متساويا من قوارير الاسترداد الإجمالية وقوارير الاسترداد القصوى في نفس مواضع التفاعل للغرفة اليسرى HDX والغرفة اليمنى HDX على التوالي. بعد ذلك ، قم بإعداد قائمة نموذجية باستخدام طرق LC و MS المناسبة في برنامج الجدولة وابدأ الجدول.

للحصول على خريطة تغطية الببتيد النهائية، قم يدويا بتنظيم التعيينات النظيرية في برنامج تحليل بيانات DynamX HDX. بعد تنظيف أداة النموذج الأولي Fast HDX ، افتح واجهة المستخدم الرسومية لبرنامج HDX المتوافق لتهيئة النظام. أدخل 20 درجة مئوية و 0.5 درجة مئوية كدرجة حرارة غرفة العينة وغرفة التبريد على التوالي ، متبوعا بالنقر فوق تعيين لتطبيق درجات الحرارة الجديدة.

لتنظيف الجهاز وإعداده، قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي بمياه من الدرجة LC/MS في جميع المداخل، ثم تحقق من كل من المحاقن اليسرى واليمنى في علامة تبويب توصيل السباكة المعايرة واستمر في النقر فوق Prime حتى تختفي جميع فقاعات الهواء الكامنة في الأنابيب. للتحقق من جميع مربعات المحاقن ، انتقل أولا إلى علامة التبويب وحدات الماكرو وانقر فوق معايرة موضع المحاقن في المنزل ، ثم انقر أولا فوق حلقة تحميل المحاقن ، متبوعا بغسل جميع وحدات تخزين حلقة الخلط. إذا كانت هناك أي فقاعة في حقنة عازلة، فافصل المحقنة وقم بتفكيكها عن طريق إخراج الفقاعة عموديا.

قبل إعادة المعايرة إلى الموضع الصفري ، استبدل المحقنة. لإعداد أداة النموذج الأولي Fast HDX لتجارب HDX ، قم أولا بإدخال أنبوب مدخل المعايرة بالتحليل الحجمي الأيسر في قارورة الاسترداد الإجمالية. لمنع قلة القلة والتجميع الناجم عن درجة الحرارة، ضع الأنبوب في ثلاجة على الطاولة.

بعد ذلك ، أضف 50 ملليلتر من مخازن التوازن ووضع العلامات والتبريد وغسل البيبسين إلى مداخل المخزن المؤقت المعنية في الغرف اليمنى واليسرى من الأداة ، متبوعا بإضافة 50 ملليلتر من المخزن المؤقت لغسل العمود إلى مدخل غسيل البيبسين. لتحضير خطوط غسيل البروتين والأعمدة، تحقق من المحاقن اليمنى واليسرى في علامة التبويب تسليم السباكة المعايرة وانقر فوق Prime مرة واحدة. بعد التحقق من جميع مربعات المحاقن كما هو موضح سابقا ، انتقل إلى علامة التبويب تدفق التبريد اليدوي لإدخال الإعدادات المطلوبة.

بالنسبة لتجربة دورة زمنية، استخدم زر النقطة الرمزية لإدخال الأوقات بالمللي ثانية. ثم اضبط وقت الملائمة على ثلاثة وانتظر HPLC لملائمة الوقت بالإضافة إلى وقت التشغيل بالإضافة إلى 1.5 دقيقة. إذا تم تشغيل تجارب فارغة بين عمليات تشغيل العينة، فانقر فوق مربع التشغيل الفارغ بعد التأكد من إدخال في برنامج الاكتساب للتشغيل الفارغ بعد كل تشغيل عينة.

بمجرد أن تصبح قائمة العينة جاهزة وتم تمييز الإدخالات المناسبة ، ابدأ التشغيل بالنقر فوق تشغيل و Fast HDX في البرنامج. لمعالجة البيانات، افتح قائمة الملفات الخاصة بملف الببتيدات المعينة الطيفية من تجارب رسم خرائط الببتيد وانقر فوق فتح في برنامج DynamX، ثم قم باستيراد الملفات الخام إلى برنامج DynamX. بعد فتح قائمة البيانات ، انقر فوق MS Files.

لإنشاء حالات لكل حالة بروتين قيد الدراسة ، انقر فوق حالة جديدة. لإضافة كل نقطة زمنية HDX، انقر على التعرض الجديد، ثم انقر على خام جديد. لاستيراد الملفات الخام، اسحب كل ملف إلى الموضع الصحيح وانقر فوق موافق عند الانتهاء.

بعد تعيين النظائر تلقائيا، قم بتنظيم تعيين النظائر يدويا لضمان جودة بيانات عالية. تصدير بيانات الكتلة في ملف csv بترتيب الأعمدة كما هو موضح في المخطوطة. افتح قائمة البيانات في برنامج قياس الكتلة وانقر على تصدير بيانات المجموعة.

لتحليل البيانات، قم أولا بتحميل البيانات المجمعة المصدرة إلى برنامج تحليل HDX HDfleX. لتناسب البيانات التجريبية لجميع التجارب والحالات، حدد طرق تصحيح التبادل الخلفي المناسبة للحصول على ثوابت المعدل المرصودة لتفاعل HDX. ثم احسب عتبة الأهمية العالمية باستخدام طريقة مفضلة في HDfleX وقم بإجراء اختبار الدلالة الهجينة لتحديد الاختلافات الكبيرة عبر الحالات المقارنة.

ولدت تجربة رسم الخرائط على ألفا سينوكلين خريطة تغطية الببتيد التي غطت 100٪ من تسلسل البروتين بمتوسط تكرار قدره 3.79. علاوة على ذلك ، مكن هذا البروتوكول من توليد منحنيات امتصاص الديوتيريوم لببتيدات مختلفة من ألفا سينوكلين ، والتي تم التعبير عنها بعد ذلك كرسوم بيانية مثبتة وخلفية للتبادل التصحيحي. كان من الواضح أن معظم تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم في ألفا سينوكلين تم في ثانية واحدة.

كان الفرق التوافقي بين الحالتين A و B من ألفا سينوكلين واضحا أيضا من امتصاص الديوتيريوم الأعلى من قبل الحالة B على مستوى الببتيد والأحماض الأمينية. بالنسبة لمثل هذه التقنية الحساسة ، من المهم استخدام اختبارات دلالة إحصائية قوية عند مقارنة البيانات. هنا ، استخدمنا برنامجنا HDfleX.